Hranic, v Buněčné Neurovědy

Úvod

neurotrophin nervový růstový faktor (NGF) se podílí několik kritických procesů v rozvojových a zralé savčí nervový systém, včetně cílové inervace, diferenciaci buněk a neuronální přežití (Large et al., 1986; Li et al., 1995; Sofroniew et al., 2001; Lad et al., 2003). V dospělém mozku hraje NGF klíčovou roli v udržování a funkci bazálního předního mozku cholinergního systému (Lad et al., 2003). Úrovně NGF jsou nejvyšší v oblastech, které dostávají největší počet cholinergních projekcí bazálního předního mozku, jmenovitě hipokampus a kůra (Korsching et al ., 1985; Shelton a Reichardt, 1986), a receptory pro NGF v kůře jsou do značné míry omezeny na bazální přední mozek corticopetal projekce (Kordower et al., 1988; Sofroniew et al., 2001; Rossi a kol., 2002). Signalizace nervového růstového faktoru udržuje cholinergní kortikopetální projekce během dospělosti (Chen et al ., 1997; Debeir et al., 1999) a může zabránit degeneraci těchto neuronů po přetnutí jejich axony (Hefti, 1986; Tuszynski et al., 1990; Kordower et al., 1994). Kromě toho NGF zvyšuje uvolňování acetylcholinu z bazálních předních mozkových kultur (Auld et al., 2001) a může modulovat cholinergní funkci prostřednictvím fenotypové kontroly lokusu cholinergního genu (Rylett et al ., 1993; Hu et al., 1997).

bazálního předního mozku cholinergní systém ovlivňuje učení a zkušenosti-dependent plasticity v kůře (Bakin a Weinberger, 1996; Kilgard a Merzenich, 1998; Conner et al., 2003, 2005), a NGF signalizace byla vyslovena hypotéza, podpořit a případně zvýšit, bazálního předního mozku-zprostředkované učení a plasticity. Například blokáda NGF signalizace přes opakované injekce NGF protilátek v insulárním kortexu snižuje místní cholinergní inervace a narušuje pořízení dvou procesů, které jsou závislé na integritě cholinergní vstupy, podmíněné chuťové averze a inhibičního vyhýbání se učení (Gutierrez et al., 1997). Nedávná studie Conner et al. (2009) ukázala, že obě prostorové učení a hipokampu dlouhodobé potenciace (LTP) jsou rozšířeny po infuzích NGF do septální jádra, primární zdroj cholinergní inervaci hipokampu.

fokální aplikace NGF může také vyvolat rychlou expanzi lokálního zastoupení vousů v barelové kůře krys. Tento proces je závislý na cholinergních projekcích z bazálního předního mozku (Prakash et al ., 1996, 2004), což naznačuje, že kortikální signalizace NGF může stimulovat rychlou cholinergně závislou funkční reorganizaci. NGF se tedy kromě dlouhodobých trofických účinků na cholinergní buňky bazálního předního mozku může také podílet na krátkodobé remodelaci obvodu. Tento „dual-action“ hypotéza je podporována existence konstitutivní a činnosti závislé na uvolnění mechanismy NGF (Blochl a Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), které jsou potenciálně základem dlouhodobých trofických a krátkodobých modulačních účinků NGF. Kromě toho byly pro NGF pozorovány jak retrográdní (dlouhodobé), tak lokální (krátkodobé) signální dráhy (Huang a Reichardt, 2003).

Buněk exprimujících NGF byly zjištěny v kůře, mozečku, hipokampu, thalamu, striatu, bazálního předního mozku a mozkového kmene (Gall a Isackson, 1989; Maisonpierre et al., 1990; Isackson et al., 1991; Conner a Varon, 1992; Hayashi a kol., 1993; Mufson a kol., 1994; Zhang et al., 2007). Ačkoli NGF mRNA byla údajně pozorována v astrocytech a jiných gliích, drtivá většina kortikálních NGF je produkována neurony (Sofroniew et al ., 2001). Specifické typy neuronů, které produkují NGF v kůře, však nejsou známy a ukázalo se, že cholinergní kortikopetální projekce inervují excitační i inhibiční neurony v kůře (Zaborszky et al ., 1999). V mimokortikálních oblastech, jako je hippocampus, striatum a bazální přední mozek, je produkce NGF převážně lokalizována na GABAergní inhibiční neurony (Lauterborn et al ., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon a kol., 1999). Identifikace buněk produkujících NGF v kůře je důležitá pro identifikaci potenciálních mechanismů, které jsou základem modulace cholinergních kortikálních vstupů, a mechanismy kortikální plasticity. V současné studii identifikujeme podmnožinu kortikálních GABAergních buněk jako primární zdroj produkce NGF v dospělé kůře, s relativně vzácnou produkcí glutamatergickými neurony.

materiály a metody

všechny subjekty byly léčeny v souladu s institucionálními pokyny pro péči o zvířata. Vzhledem k nízké endogenní hladiny kortikální NGF výraz, který zakazuje identifikace specifických buněk–typ zdroje NGF v předchozích studiích, jsme provedli místní kolchicin čaje inhibují mikrotubulové polymerace, čímž blokuje NGF dopravy pryč z těla buňky a má za následek hromadění zjistitelné NGF antigen v soma produkovat buňky (Schubert et al., 1972; Hokfelt a kol., 1975; Hanson a Edström, 1978; Conner a Varon, 1992). Předchozí zprávy ukázaly, že léčba kolchicinem zvyšuje detekci NGF pomocí imunohistochemických technik(Conner a Varon, 1992). Kromě toho hladiny kolchicinu podobné hladinám použitým v současné studii nevyvolávají hrubé abnormality v neuronální distribuci člena rodiny neurotrofinů BDNF(Conner et al ., 1997).

Příprava Tkáně

Osm dospělých Fischer 344 potkanů (4 samci, 4 samice; Harlan Sprague Dawley) byly v narkóze s 2 ml/kg 25 mg/ml ketaminu, 1,3 mg/ml xylazinu, a 0,25 mg/ml acepromazin koktejl, a injekčně s 5.0 µl kolchicinu (10 µg / µl v aCSF) na níže uvedených kortikálních místech rychlostí 0, 5 µl/min za použití 10 µl Hamiltonovy stříkačky. Po infuzi zůstala jehla na místě po dobu čtyř minut, aby se umožnila dostatečná difúze do okolní tkáně. Čtyři zvířata obdržel bilaterální injekce v primární motorické kůry (M1) na +1,2 mm přední (A/P) a ±2,5 mm / boční (M/L) bregma. Polovina roztok byl nastříknut na 1,6 mm pod povrch mozku (D/V), a zbytek při 1,0 mm. Zbývající čtyři zvířata, všechny přijaté jednostranné injekce v prefrontální kůře (A/P: +3.0, M/L: +0.5, D/V: -2.3 a -1.8), temporální kůře (A/P: -6.5, M/L: +5.0, D/V: -7,5 a -7.0) a parietální kůře (A/P: -3.0, M/L: +5.0, D/V: -1.8 -1.3 a). Po 48 h, byla zvířata hluboce uspaný a transcardially perfundovaného s 250 ml studené fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (pH 7.4), následovaný 250 ml studeného 2% paraformaldehyd + 0.2% parabenzoquinone v 0,1 M fosfátovém pufru. Mozky byly extrahovány, postfixovány po dobu 2 hodin ve stejném fixativu a kryoproteovány v 0,1 m fosfátovém pufru obsahujícím 30% sacharózy po dobu nejméně 72 hodin při 4°C. Koronální části (40 µm) byly sníženy na zmrazení posuvné mikrotom a uloženy v ochranném (TCS) při 4°C, dokud dále zpracovávány pro imunohistochemii.

Double-Label Fluorescenční Imunohistochemie

Sekvenční double-label imunohistochemie byla použita k vizualizaci neuronů exprimujících NGF a buď Gabaergních nebo glutamátergní buněčné markery. Free-plovoucí řezy byly promyty v Tris pufru (TBS), permeabilized 0,25% Triton X-100, a nespecifické značení byl pak zablokován s 5% oslí sérum. Řezy byly inkubovány po dobu 72 hodin při teplotě 4°C v králičí anti-NGF protilátek (Conner a Varon, 1992) ředěné 1:1000 v TBS, 0.25% Triton X-100 a 5% oslí sérum. Následující primární protilátky inkubace, řezy byly inkubovány v donkey anti-rabbit biotin-konjugátu IgG (1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Tyramide zesílení signálu (TSA; PerkinElmer, Waltham, MA, USA) byl použit k zesílení NGF signál, po kterém řezy byly promyty v TBS a inkubovány v Alexa Fluor 488 nebo 594-konjugovaný streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) v poměru 1:200 po dobu 3 h při teplotě 4°C. Po krátkém mytí, řezy byly inkubovány v obou myší anti-hydrogen-glutamát dekarboxylázou (GAD) 65 (GAD-6, AntibodyRegistry:AB_528264,1:2000; Vývojové Studie, Hybridomu, Banky, Iowa City, IA, USA) a mouse anti-GAD67 (AnitbodyRegistry: AB_2278725, 1:1500; Millipore, Temecula, CA, USA), nebo v myší anti-parvalbumin (AntibodyRegistry: AB_2174013, 1:30000; Millipore, Temecula, CA, USA), myš anti-calbindin-D-28K (AntibodyRegistry: AB_476894, 1:1500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), nebo myší anti-Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinázy Ii (CaMKIIa, AntibodyRegistry: AB_2067919, 1:1500; Millipore) za 72 h při teplotě 4°C. Konečně, sekce byly umyty, inkubovány v Alexa Fluor 594 nebo 488-konjugované donkey anti-mouse (Invitrogen) po dobu 3 h při pokojové teplotě, promyty znovu, namontované na sklíčka, a coverslipped v Fluoromount G (Jižní Biotech, Birminghan, AL, USA). Aby se maximalizovala identifikace GABAergních buněk, byly současně inkubovány protilátky GAD65 a GAD67. Podmnožina sekcí byla pokryta ProLong Gold s Dapi (Invitrogen) pro vizualizaci buněčných jader.

Charakterizace Protilátek

NGF protilátky použité v této studii je afinitně čištěné polyklonální vyrůstal v králíka proti čištěné myši NGF (Conner a Varon, 1992). Protilátka rozpoznává purifikovanou myš a rekombinantní lidský NGF, ale nekříží reaguje s rekombinantním BDNF nebo NT-3(Conner a Varon, 1996). Kromě toho, podobná vzor NGF výraz v mozku potkana odpovídá, že získaná z in-situ analýzu v mozku potkana (Conner a Varon, 1997).

monoklonálních protilátek GAD-65 (Vývojové Studie, Hybridomu, Banky, Gad-6) byl vyroben imunizací myší s GAD proteinů imunoafinitní-čistí z mozku potkana. Western blot analýza homogenáty potkaního mozku odhalil protilátky selektivně rozpozná GAD-65, ale ne GAD-67 (Chang a Gottlieb, 1988). Další studie ukázaly, že protilátka GAD-6 rozpoznává epitop umístěný mezi aminokyselinami 475-571 C-konce GAD-65 (Butler et al., 1993).

myš GAD-67 monoklonální (Millipore, MAB 5406, lot: 25010139) byla vznesena proti aminokyselinových zbytků 4-101 lidských GAD-67, a uznává jediného 67-kDa kapela na Western blot analýzy z mozku potkana (výrobce technické informace). Preinkubační protilátky s GST-GAD-67 fusion protein za následek žádné immunopositive signál v mozku (Ito et al., 2007).

myší monoklonální anti-CaMKIIa (Millipore, MAB 8699, hodně: LV1366080) výslovně uznává alfa podjednotku vápník/calmodulin-dependentní protein kinázy II. Western blot analýza ukazuje, že protilátka identifikuje jediný pás 50 kDa a rozpoznává fosforylované i nefosforylované formy (Erondu a Kennedy, 1985).

Monoklonální anti-calbindin-D-28k (Sigma–Aldrich, C9848, hodně: 088k4799) je odvozen z BALB/c myši byly imunizovány s čištěný bovinní ledviny calbindin-D-28k. Imunoblotingu ukázal protilátka rozpozná 28 kDa kapely, a nebude reagovat s podobnými molekulami, jako calbindin-D-9K, calretinin, myosin lehký řetězec, a parvalbumin (výrobce technické informace). Preabsorption s calbindin-D-27 kDa protein purifikován z kočka a krysa mozku bylo prokázáno, že k odstranění calbindin immunostaining v mozku (Pasteels et al., 1987).

Anti-parvalbumin (Millipore, MAB 1572, lot: LV1378387) byl odebrán z myší imunizovaných proti parvalbuminu purifikovanému z žabího svalu. Monoklonální protilátka je namířena proti epitopu na první Ca2+-vazebné místo a immunoblot analýza ukazuje, rozpozná mozku protein of 12 kDa (výrobce technické informace).

Konfokální Analýza

Snímky byly pořízeny pomocí Olympus AX70 s Magnafire software (verze 2.0; Karl Storz Imaging, Goleta, CA, USA). Protože NGF značení byla podstatně snížena přibližně 2 mm, přední/zadní, aby kolchicin injekce stránek, pravděpodobně kvůli nedostatku kolchicin difúze a výsledná absence somatických NGF akumulace, pouze úseky do 1,5 mm na každý kolchicin injekce byly analyzovány. Každý 10. úsek (400 µm) byl vyšetřen v kortikální oblasti. Buňky byly ručně počítány a nejméně tři sekce byly analyzovány v každé kortikální oblasti a kombinaci protilátek na subjekt. Pouze tři zvířata byla hodnocena v časové oblasti kvůli nedetekovatelnému značení NGF ve čtvrtém. Jednotlivé a dvojitě značené buňky byly kvantifikovány pomocí jednokanálových i dvoukanálových obrazů. K identifikaci značených buněk bylo použito několik kritérií, včetně velikosti, morfologie, signálu vs. pozadí a náhodného značení DAPI při hodnocení tkáně obarvené DAPI. V podskupině sekcí byly shromážděny 5 µm z-stohy pomocí Olympus Fluoview FV1000 pro zajištění neuronální lokalizace značeného objektu. Vzhledem k našemu zájmu o podíl, a nikoli absolutní počet, dvojitě značených buněk, nebyly použity stereologické metody.

procento dvojitě značených buněk na imunoreaktivní (IR) buněčnou skupinu bylo stanoveno pro každé obrazové pole. Průměrná ± standardní chyba byla vypočtena pro každou zkoumanou kortikální oblast. K vyhodnocení rozdílů mezi kortikálními oblastmi byla použita jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). Fisherovo HSD bylo použito pro post-hoc analýzu. Všechny statistické analýzy byly provedeny s SPSS 15.0 pro Windows.

kontroly protilátek

kontroly zahrnovaly vynechání primárních protilátek, vynechání sekundárních protilátek a nahrazení primární protilátky nespecifickou protilátkou (králičí IgG). Všechny manipulace měly očekávané účinky a podpořily tvrzení, že značené buňky představují skutečné značení antigenu jejich odpovídajícími protilátkami.

výsledky

IMUNOZNAČENÍ NGF

zřetelné značení NGF bylo viditelné v okruhu 1.5 mm od kolchicinových kortikálních míst vpichu. V těchto oblastech bylo značení NGF převážně omezeno na buněčné somata (Obrázek 1). Zřídka lze také rozlišit jeden nebo více buněčných procesů. Mimo tento poloměr 1,5 mm bylo značení NGF v kůře prakticky Nedetekovatelné. Protože kortikální exprese receptorů NGF TrkA a p75 jsou omezeny na cholinergní kortikopetální vlákna, pozorované značení NGF pravděpodobně neodráží endocytovanou NGF, ale místo toho svědčí o buňkách produkujících NGF (Holtzman et al., 1995; Rossi a kol., 2002; Stephens et al., 2005). Jak bylo uvedeno dříve (Ribak et al., 1978), léčba kolchicinem zesílila značení GAD v buněčných tělech i neuronálních procesech. Kolchicin neměl žádný detekovatelný účinek na označování parvalbuminu, kalbindinu nebo Kamkie.

NGF a Gabaergní Co-Lokalizace

Nervový růstový faktor co-lokalizované značně s Gabaergní buňky markery GAD65 a GAD67, bez ohledu na kortikální oblasti, zkoumal (Obrázek 1; Tabulka 1). Celkově 91 ± 0,9% kortikálních buněk značených NGF také značených pro GAD65 / 67. Procento NGF-označených buněk co-vyjádření GAD65/67 ukázal malý rozdíl mezi prefrontální (90.0 ± 1.5%), motor (91.7 ± 1.5%), temenní (89.6 ± 3.5%) a časové (93.4 ± 8.1%) kůry mozkové (one-way ANOVA; p = 0.78). Naopak, NGF co-lokalizované s pouze 55 ± 2.3% všech buněk značených GAD65 / 67. K určení, zda NGF výroba byla omezena na konkrétní podtyp Gabaergních neuronů, jsme společně označené tkáně pro NGF a buď parvalbumin, nebo calbindin (Obrázek 2). Bylo pozorováno, že buňky značené NGF kolokalizují s oběma markery. KOLOKALIZACE NGF s parvalbuminem (67,8 ± 3,6%) však byla o více než 2× větší než u kalbindinu (29,1 ± 3,9%). Kromě toho buňky NGF-IR tvořily méně než polovinu všech imunoreaktivních buněk parvalbuminu (47,7 ± 4,6%) a kalbindinu (25,7 ± 4,9%).

neurony exprimující nervový růstový faktor byly pozorovány ve všech kortikálních vrstvách. Předchozí studie uvádějí, nerovnoměrné rozložení NGF-označené neuronů v kortikálních lamely (Pitts a Miller, 2000; Patz a Wahle, 2006). Kvantitativní analýza vrstva nebyla provedena v aktuální studii, nicméně, jak NGF označování intenzita poklesla s rostoucí vzdáleností od kolchicin injekce.

NGF a Glutamátergní Co-Lokalizace

Označování pro CaMKIIa byla primárně pozorována v buněčné somata a proximální procesy (Obrázek 3). Na rozdíl od rozsáhlé ko-lokalizace viděn s NGF a Gabaergní značky, NGF-označené buňky zřídka ko-lokalizována s CaMKIIa-označené buňky (Obrázek 3; Tabulka 2). Celkem 4.9 ± 1,1% NGF-imunoreaktivních buněk byl co-označeny CaMKIIa protilátky. Ko-lokalizace výrazně lišila podle kortikální oblasti (one-way ANOVA; p = 0.03); Fisherův post hoc ukázal, že prefrontální kůra měla větší podíl double-označených buněk NGF (7.6 ± 2.1%) ve srovnání s primární motorické kůry (2.4 ± 1.0%; p = 0.02) a parietální kůry (2.9% ± 1.5; p = 0,01).

buňky imunoreaktivní pro Kamkii výrazně převyšovaly buňky označené protilátkami NGF. Celkový podíl buněk značených Camkiií současně exprimujících NGF signál byl 2 ± 0,6%. Toto procento se výrazně lišila podle regionu (one-way ANOVA p = 0.003), s prefrontálním kortexu, které vykazuje větší podíl dvojitě značené NGF/CaMKIIa buněk (3.7 ± 1.1%) než primární motorické kůry (0.8% ± 0.3; p = 0,001), parietální kůry (1.4% ± 0.6; p = 0,01), a temporální kůře (1.5 ± 0.6%; p = 0,01).

Diskuse

současná studie ukazuje, že drtivá většina (>90%), NGF-produkující neurony kůry jsou Gabaergní, zatímco polovina všech Gabaergní neurony colocalize s NGF. Naproti tomu markery excitačních neuronů vykazují pouze vzácnou lokalizaci s NGF. Tyto výsledky byly konzistentní ve více kortikálních oblastech analyzovaných v této studii, což naznačuje, že NGF je primárně produkován inhibičními interneurony v neokortexu potkanů.

ačkoli se imunoreaktivita NGF zřídka shodovala s markery excitačních buněk (Camkia), malé procento (~5%) bylo pozitivní na Kamkii ve všech zkoumaných kortikálních oblastech. Konfokální analýza potvrdila, že toto dvojité značení pochází ze stejné ohniskové roviny a nebylo způsobeno diskrétním signálem pocházejícím z překrývajících se buněk. Funkční význam exprese NGF v tak malé frakci excitačních buněk není znám, ale je možné, že tyto neurony produkující NGF představují dříve neidentifikovanou podtřídu excitačních neuronů v neokortexu.

Naše výsledky jsou v souladu s nálezy předchozích studií v dalších oblastech mozku prokazují, že NGF co-lokalizuje téměř výhradně s Gabaergní buňky striata, bazálním předním mozku a hipokampu (Lauterborn et al., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon a kol., 1999). Produkce NGF Gabaergními buňkami tedy může být obecnou vlastností všech cílů, které dostávají cholinergní inervaci bazálního předního mozku (včetně samotného bazálního předního mozku). Tyto cholinergní neuronální populace vyžadují NGF pro udržení jejich fenotypu a projekcí (Rylett et al., 1993; Chen et al., 1997; Hu et al., 1997; Debeir et al., 1999). Napříč studiemi se inhibiční interneurony nyní objevují jako primární zdroj trofismu NGF pro cholinergní neurony bazálního předního mozku.

ačkoli bazální přední mozek cholinergní neurony inervují jak excitační, tak inhibiční kortikální sítě (Zaborszky et al ., 1999), zdroj trofické podpora je v drtivé většině od inhibiční populace, které je známo, že hrají klíčovou roli ve zprostředkování plasticity na kortikální okruhy (Hensch a Stryker, 2004; Yazaki-Sugiyama et al., 2009; Donato a kol., 2013). Zdá se, že cholinergní signalizace přispívá k diferenciální aktivaci různých inhibičních subpopulací, čímž moduluje excitačně-inhibiční rovnováhu (Xiang et al., 1998; Froemke a kol., 2007). NGF tak může sloužit jako zpětnovazební signál mezi vysoce plastickými inhibičními sítěmi a cholinergními vstupy, které je aktivují. NGF skutečně zvyšuje plasticitu a behaviorální učení prostřednictvím cholinergně závislých mechanismů (Prakash et al ., 1996, 2004; Gutierrez et al., 1997; Conner a kol., 2009). Uvolnění NGF závislé na aktivitě (Blochl a Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), spárovaná se schopností NGF zvýšit cholinergní aktivitu (Rylett et al., 1993; Hu et al., 1997; Auld et al., 2001), naznačuje, že NGF může podporovat reorganizaci aktivních obvodů pomocí vylepšené cholinergní funkce.

Budoucí studie se pokusí určit, které podtřídy inhibičních neuronů express NGF a jak tento výraz přesně ovlivňuje kortikální obvody. Za tímto účelem jsme vzali předběžné kroky k určení, zda NGF ko-lokalizována s dva společné znaky inhibiční neurony, parvalbumin (primárně je jim přiřazen program koš a lustr buňky) a calbindin (spojené s mnoha inhibiční typy buněk; McBain a Fisahn, 2001; Markram et al., 2004). Naše výsledky ukazují, že NGF, byl primárně zjištěn v parvalbumin-imunoreaktivních buněk, ačkoli mnoho buněk označeny parvalbumin ne co-express NGF. Důležité je, že buňky NGF-IR jsou také kolokalizovány buňkami značenými kalbindinem, což naznačuje, že více než jedna podtřída inhibičního neuronu produkuje NGF.

V souhrnu, v rámci rat neokortexu NGF je především vyjádřena tím, že inhibiční neurony, vlastnost, která se zdá být zachovány z fylogeneticky starší oblasti mozku a které se mohou zobecnit na mozek jako celek. Naše výsledky naznačují, že kortikální inhibiční interneurony hrají zásadní roli při udržování cholinergních projekčních neuronů bazálního předního mozku. GABAergní interneurony tak mohou podporovat kortikální reorganizaci prostřednictvím regulované signalizace NGF.

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

Financován NIH (AG10435), Veterans Administration, Alzheimerovy Asociace a Dr. Miriam a Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation.

Doplňkový Materiál

Doplňkový Materiál pro tento článek lze nalézt online na: http://www.frontiersin.org/journal/10.3389/fncel.2014.00220/abstract