fedme og tilknyttede comorbiditeter, for eksempel diabetes, hypertension og hjerte-kar-sygdomme, repræsenterer de mest almindelige sundhedsrisici over hele verden, og forekomsten er mere end fordoblet i de sidste 35 år og er allerede opstået i barndommen. Biologisk, for at fedtmassen kan akkumuleres udover proliferation, er differentiering af fibroblastlignende forløberceller (preadipocytter) til lipidfyldte modne adipocytter en vigtig proces med vævsudvidelse. Derfor er forståelsen af de molekylære begivenheder i denne proces med adipocytudvikling, differentiering og biologi af voksende betydning.
Preadipocytcellelinjer, såsom murine 3T3‐L1 eller primære adipocytter fra mus, rotter eller mennesker tjener som eksperimentelle modeller for human adipogenese og bruges i vid udstrækning til at karakterisere adipogene regulatorer og derved give betydelig indsigt i de molekylære processer, der regulerer adipogenese. Ikke desto mindre er der nogle begrænsninger for generaliserbarheden til fysiologien af human adipogenese, som for eksempel 3T3‐L1-celler spontant udødeliggøres aneuploide embryonale fibroblaster, og de er afledt af mus. På den anden side kan primære humane preadipocytter ikke udvides til høje celletal uden at miste deres evne til at differentiere til modne adipocytter. Desuden er der høj grad af interindividuel variabilitet for forbigående kulturer fra celler af individer, hvilket begrænser generaliserbarheden.
i 2001 blev der etableret en human preadipocytcellelinie afledt af en dreng med Simpson–Golabi–Behmel syndrom (SGBS), som viste sig at være et egnet modelsystem til in vitro-undersøgelser i adipocytforskning. SGBS preadipocytter er af menneskelig oprindelse, diploide, differentierer i et serumfrit, kemisk standardiseret medium og muliggør reproducerbare eksperimenter, da celletallene stort set kan øges, mens cellerne bevarer deres gode differentieringskapacitet i mere end 30 generationer. SGBS-modellen er blevet brugt til adskillige undersøgelser, såsom farmakologisk test, genetiske påvirkninger på adipocytbiologi og adipogenese eller karakterisering af adipokiner. Som principbevis har ekspressionsprofilerne for gener som GLUT4, leptin eller lipoproteinlipase (LPL) til differentiering af SGBS preadipocytter vist sig at ligne dem for primære humane preadipocytter fra fedtvævsbiopsier. En kvalitativ sammenligning af proteiner udskilt fra SGBS preadipocytter og differentierede SGBS adipocytter er dog endnu ikke udført.
her udførte vi en omfattende analyse af protein-og ekspressionsprofilen for SGBS-celler i løbet af adipocytdifferentiering. For at karakterisere adipocytdifferentiering på proteom-og transkriptomniveauet blev humane SGBS preadipocytceller differentieret som beskrevet tidligere. Dmem / Ham ‘ s F12 indeholdende 33 liter biotin, 17 liter pantothenat, 10 liter apo‐transferrin, 20 nm insulin, 10 nm hydrocortison og 0,2 nm triiodothyroksin i 10 dage. I de første 4 dage med differentiering blev mediet yderligere suppleret med 25 nm deksamethason, 500 liter isobutyl-methylksantin og 2 liter rosiglitason (for detaljerede oplysninger se understøttende Information).
til proteomanalysen brugte vi stabil Isotopmærkning i cellekultur (SILAC) kombineret med LC‐MS/MS til en nøjagtig dybdegående kvantitativ proteomanalyse af intracellulære og udskillede proteiner som beskrevet tidligere. Alle eksperimenter blev udført i biologiske triplicater.
vi identificerede 3737 intracellulære proteiner, hvoraf 2602 blev pålideligt kvantificeret i mindst to af de tre biologiske replikater. I secretome-analysen blev der identificeret 390 proteiner, hvoraf 39 proteiner omfattede etablerede adipogene regulatorer og modulatorer, såsom apolipoprotein E (APOE) og adiponectin (ADIPOK) blev kvantificeret. Samlet set blev næsten halvdelen af de intracellulære og ekstracellulære proteiner udtrykt differentielt under adipocytdifferentiering (figur 1a).
analysen af den subcellulære lokalisering af proteiner i henhold til Go (Gen ontologi) databaseanmærkning viste berigelse af cytoplasmatiske proteiner, men også af nukleare og mitokondrielle proteiner (figur 1b). 1135 intracellulære proteiner og 18 secernerede proteiner blev bestemt til at være signifikant reguleret med en log2 fold ændring på >0.5 og en p-værdi på < 0,01 (to tailed t‐test med ulige varians) (figur 1C, tabel S1, understøttende Information).
alle regulerede proteiner blev grupperet i henhold til de annoterede go-biologiske processer og kanoniske veje såvel som deres tildeling til metaboliske veje som leveret af Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). Størstedelen af de regulerede proteiner er involveret i metaboliske veje, f.eks. Analyse af molekylære proteinfunktioner viste en berigelse af poly (A) RNA‐bindende proteiner, cadherin‐baserede Celle-Celle-interaktionsproteiner, oksidoreduktaser, ribosomale proteiner og actinbindende proteiner (figur 2b). KEGG-vejanalyse af de differentielt udtrykte proteiner afslørede, at aminosyremetabolisme, celleåndedræt og fedtsyremetabolisme var blandt de mest signifikant regulerede (figur 2C). Flere proteiner involveret i signalvejen peroksisom proliferator‐aktiveret receptor (PPARy) blev opreguleret som beskrevet tidligere. Samlet set ledsages differentiering af adipocytter af en stor grad af differentieret proteinekspression med lipid-og aminosyremetabolismerelaterede veje, der er de mest berørte.
for en omfattende analyse af proteomet i forhold til transkriptomet analyserede vi yderligere genekspressionsprofilen under adipogenese ved hjælp af en Affymetriks Genechip-Ekspressionsanalyse. Til dette blev 5 liter Total RNA behandlet til mikroarray-analyse. Omvendt transkription, in vitro transkription, fragmentering og hybridisering af prøverne blev udført i henhold til producentens anbefalinger. Prøver blev hybridiseret til HG U133A 2.0 arrays. Scanning og første databehandling blev udført med genechip-styreprogrammet. Cel-filerne (sample cell intensity) blev importeret til GeneSpring 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) ved hjælp af RMA-algoritmen til rå databehandling. Hvert gen på hvert array blev normaliseret til medianen af alle målinger af dette gen. Et gen blev generelt betragtet som ikke udtrykt, når det rå ekspressionssignal var under 100 i alle prøver. I principal component analysis grupperes prøverne betryggende i forskellige trin af differentiering (figur S1, understøttende Information). Til statistisk analyse blev prøver grupperet i preadipocytter (n = 3), tidlig differentiering (n = 3), mellemliggende fænotype (n = 2) og modne adipocytter (n = 3) i henhold til ekspressionsprofiler (understøttende Information). Varianserne estimeret af Cross‐Gen-Fejlmodellen blev yderligere anvendt til statistisk test. Data blev deponeret i Proteomics identifikations database (PRIDE) og GEO datasæt GSE123385.
i alt blev 14372 ud af 22277 testede transkripter udtrykt i SGBS-celler på ethvert tidspunkt af differentiering, der koder for 9346 unikke proteiner. 1520 af disse blev også kvantificeret på proteinniveau (tabel S2, understøttende Information). 313 gener (3,3%) repræsenteret af 404 (2,8%) transkripter havde ekspressionsændringer >fem gange under adipocytdifferentiering (tabel S3, understøttende Information). Korrelationsanalyser afslørede, at regulering på proteinniveauet i høj grad svarede til transkriptomniveauet, der sammenlignede adipocytter med preadipocytterne (figur S2, understøttende Information).
dernæst analyserede vi typisk adipocytmarkørekspression under adipogenese på transkriptom-og proteomniveauet for at teste robustheden af den molekylære signatur af differentiering. Vi fandt en opregulering af proteiner involveret i adiponectinekspression, cholesterolsyntese (acetyl‐CoA acetyltransferase, lipase E), aminosyremetabolisme (aminoacylase) og af faktorer involveret i lipogenese og lipolyse (acetyl‐CoA carboksylase-og-cholesterol-syntese (acaca, ACACB)). Derudover blev typiske markører for modne adipocytter som LPL, fedtsyrebindende protein 4 (FABP4), fedtsyresyntase (FASN), stearoyl‐CoA desaturase og APOE opreguleret. I modsætning hertil blev der observeret en nedreguleret inhibitor af carboksypeptidase A1, 2 og 4. Vi identificerede de tre præadipocytmarkører, transkriptionsfaktor GATA-6 (GATA6) og C‐H‐C motiv kemokin 6 (C-CL6) og de fire modne adipocytmarkører LPL, ACACB, APOE og ATP citratlyase (ACLY) (figur S3, understøttende Information).
for at validere markørgenekspressionsprofilerne og identificere dem med den højeste forudsigelsesevne for adipocytstatus udførte vi TAKMAN RT‐PCR i tre uafhængige SGBS-differentieringseksperimenter (understøttende Information). I SGBS-celler var vi i stand til at validere genekspressionsprofilerne for alle syv markørgener og viste en signifikant regulering under SGBS-differentiering. Fem markørgener valideret med kpcr i SGBS-celler blev også reguleret i samme retning på proteomniveauet (figur 3). Acacb, ACYL, ADIPOK og APOE blev signifikant opreguleret i modne adipocytter, mens LCN var signifikant nedreguleret.
taget sammen, SGBS adipocytter udviser nøglefunktioner og nøgleprotein-og mRNA-signaturer af primære pattedyrs adipocytter, for eksempel, morfologiske egenskaber såvel som molekylære kendetegn som aktivering af PPARy-vejen. Her viser vi, at også ekspressionen af flere typiske adipokiner (f.eks. ADIPOK) og modne adipocytmarkører (f. eks. LPL, FABP4, FASN) induceres i SGBS celledifferentiering. Desuden afslører de opnåede data en metabolisk programmering under adipogenese, hvor lipidmetabolismerelaterede veje er de mest berørte.
vi forventer, at de proteomiske og transkriptomiske data, der præsenteres her, er af interesse for den videre anvendelse og etablering af SGBS‐celler som et velkarakteriseret modelsystem til adipocytdifferentiering såvel som til identifikation af markørgener, som kan bruges til at karakterisere humane fedtvævsbiopsier med hensyn til sammensætning og differentieringstilstand. Vores data kan lette og vejlede fremtidige undersøgelser med fokus på regulering af adipogenese og humane adipocytsignaturer.