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Arsen ist ein humanes Karzinogen der Klasse I, das ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darstellt. Arsenexposition ist mit Hautkrebs, Blasenkrebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und peripheren Gefäßerkrankungen verbunden (1, 2). Die US Environmental Protection Agency (EPA) rangiert Arsen an erster Stelle auf ihrer Superfund-Liste gefährlicher Stoffe (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
Arsen wird durch geothermische Aktivität, durch Auflösung von Mineralien und durch anthropogene Aktivitäten wie industrielle Abwässer, Verbrennung fossiler Brennstoffe und die Verwendung von arsenhaltigen Pestiziden, Herbiziden, Holzschutzmitteln und Futtermittelzusatzstoffen in die Umwelt freigesetzt (3). Infolge der Verwendung von mit Arsen kontaminiertem Bewässerungswasser reichert sich Arsen in Reis an, dem Grundnahrungsmittel für die Hälfte der Weltbevölkerung (4). Arsenmethylierung ist ein Entgiftungsweg (5, 6). Viele Organismen haben Gene, die für Arsenit-S-Adenosylmethionin (SAM) -Methyltransferasen (in Mikroben als ArsM und in höheren Organismen als AS3MT bezeichnet) kodieren, die As (III) in methylierte Spezies mit flüchtigem ungiftigem Trimethylarsin (7) als Endprodukt biotransformieren (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida ist ein gramnegatives Bakterium, das in Wasser und Boden vorkommt, insbesondere in der Rhizosphäre bei einer relativ hohen Populationsdichte (10). Dieser Mikroorganismus wurde ausgiebig als Modell für den biologischen Abbau von aromatischen Verbindungen wie Naphthalin (11) und Styrol (12, 13) untersucht. Herkömmliche Sanierungsmethoden wie Bodenaushub mit anschließender Koagulationsfiltration oder Ionenaustausch sind teuer, störend und nicht weit verbreitet (14). Sphingomonas desiccabilis und Bacillus idriensis, die arsM exprimieren, können Arsen aus kontaminiertem Boden entfernen, aber die Expression aus einem Plasmid begrenzt ihren Nutzen (15). Pseudomonas-Arten haben die Aussicht auf Rhizoremediation organischer Verbindungen (16), wurden jedoch nicht zur Arsenentfernung verwendet.
Das Ziel dieser Studie war es, einen Stamm von P zu konstruieren. putida KT2440 mit dem Potenzial zur Entfernung von Arsen aus kontaminierten Böden. Wir verwendeten das Chlamydomonas reinhardtii arsM-Gen, das für einen ArsM-Ortholog (CrArsM) kodiert. In vitro wurde gereinigtes CRAR als(III) zu einer Vielzahl von Spezies methyliert (siehe Abb. S1A im ergänzenden Material). Nach 7 h wurden Methylarsenit und Dimethylarsenat in relativ gleichen Mengen hergestellt. Nach 14 h war das Produkt hauptsächlich DMAs(V), mit geringeren Mengen an Trimethylarsinoxid und ohne MAs(III). Diese Ergebnisse sind konsistent mit sequentiellen Methylierungsschritten zu den Mono-, Di- und Trimethylprodukten. TMAs(III) -Gas konnte auf H2O2-imprägnierten Filtern durch Oxidation zu TMAs(V)O nachgewiesen werden (siehe Abb. S1B im ergänzenden Material). Diese Ergebnisse zeigen, dass gereinigtes CrArsM drei aufeinanderfolgende Runden der As (III) -Methylierung katalysiert und toxisches anorganisches Arsen in weniger toxische oder ungiftige organische Arsen umwandelt.
Das C. reinhardtii arsM-Gen hinter dem Kanamycin-Promotor wurde in das Chromosom von P. putida KT2440 integriert, das kein arsM-Gen aufweist und Arsen nicht methyliert. Das Minitransposon-Delivery-Plasmid pBAM1 wurde als Suizidvektor verwendet, um stabile Integranten zu erzeugen, die arsM konstitutiv exprimieren konnten. Das arsM-Gen wurde in pBAM1 kloniert (siehe Abb. S2 im Supplementmaterial) und anschließend von Escherichia coli CC118λpir durch tripartite Konjugation mit einem Helferstamm auf P. putida KT2440 übertragen. Wildtyp-P. putida hat zwei chromosomale arsRBCH-Operone und kann in Gegenwart von 2 mM As (III) wachsen, was P. putida in kontaminiertem Boden einen Wettbewerbsvorteil verschafft (10). Dies könnte ein entscheidender Faktor für die Aufrechterhaltung des Zellwachstums in Gegenwart einheimischer Bakterienpopulationen sein (14). Zellen von P. putida KT2440 exprimierend CrArsM waren resistent gegen 7,5 bis 10 mM As(III) in flüssigem Basalsalz M9 Medium (Fig. 1). Die Biotransformation von Arsen durch die Zellen wurde mit 25 µM As(III) oder Arsenat (Abb. 2). Nach 12 h biomethylierte die P. putida Als(III) primär zu DMAs(V) und in geringerem Maße zu Methylarsenat (Fig. 2A). In zeitabhängiger Weise produzierten die manipulierten Zellen Dimethylarsin und TMAs(III) -Gase, identifiziert durch Oxidation zu DMAs (V) und TMAs(V) O mit H2O2 (Abb. 2B). Zusätzlich wurde das Produkt der Methylierungsreaktion in Zellen von P. putida, die CrArsM exprimieren, quantifiziert. Nach 48 h war das Hauptprodukt im Kulturmedium DMAs (V) (57% des Gesamtarsens), mit geringeren Mengen an MAs (V) (31%) und noch weniger TMAs (V)O (8%) (Abb. 2C). Der transgene P. putida-Stamm wurde als(V) methyliert (Fig. 2A, Kurve 4). Es gibt zwei arsRCBH-Operone im Chromosom von P. es ist vernünftig anzunehmen, dass die chromosomal kodierte ArsC-Reduktase As (V) schnell zu As (III), dem Substrat von CrArsM, reduziert, wodurch das Bodenbakterium sowohl As (V) als auch As (III) methylieren kann.