Adipositas und damit verbundene Begleiterkrankungen, beispielsweise Diabetes, Bluthochdruck und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, stellen weltweit die häufigsten Gesundheitsrisiken dar und die Prävalenz hat sich in den letzten 35 Jahren mehr als verdoppelt und hat sich bereits in den letzten in der Kindheit. Biologisch gesehen ist die Differenzierung von fibroblastenähnlichen Vorläuferzellen (Präadipozyten) in lipidgefüllte reife Adipozyten ein wichtiger Prozess der Gewebeexpansion, damit sich die Fettmasse neben der Proliferation ansammelt. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse in diesem Prozess der Adipozytenentwicklung, Differenzierung und Biologie von wachsender Bedeutung.
Präadipozyten‐Zelllinien wie murines 3T3-L1 oder primäre Adipozyten von Mäusen, Ratten oder Menschen dienen als Versuchsmodelle für die humane Adipogenese und werden häufig zur Charakterisierung adipogener Regulatoren eingesetzt und liefern damit substanzielle Einblicke in die molekularen Prozesse, die die Adipogenese regulieren. Dennoch gibt es einige Einschränkungen für die Verallgemeinerbarkeit auf die Physiologie der menschlichen Adipogenese, da beispielsweise 3T3‐L1-Zellen spontan immortalisierte aneuploide embryonale Fibroblasten sind und von der Maus stammen. Auf der anderen Seite können primäre humane Präadipozyten nicht zu hohen Zellzahlen expandiert werden, ohne ihre Fähigkeit zur Differenzierung in reife Adipozyten zu verlieren. Darüber hinaus besteht ein hohes Maß an interindividueller Variabilität für transiente Kulturen aus Zellen von Individuen, was die Verallgemeinerbarkeit einschränkt.
Im Jahr 2001 wurde eine humane Präadipozyten–Zelllinie, die von einem Jungen mit dem Simpson–Golabi-Behmel-Syndrom (SGBS) abgeleitet wurde, etabliert, die sich als geeignetes Modellsystem für In-vitro-Studien in der Adipozytenforschung erwies. SGBS-Präadipozyten sind humanen Ursprungs, diploid, differenzieren in einem serumfreien, chemisch standardisierten Medium und ermöglichen reproduzierbare Experimente, da die Zellzahlen weitgehend erhöht werden können, während die Zellen ihre gute Differenzierungsfähigkeit für mehr als 30 Generationen behalten. Das SGBS-Modell wurde für zahlreiche Studien verwendet, wie pharmakologische Tests, genetische Einflüsse auf die Adipozytenbiologie und Adipogenese oder die Charakterisierung von Adipokinen. Als Beweis des Prinzips wurde gezeigt, dass die Expressionsprofile von Genen wie GLUT4, Leptin oder Lipoproteinlipase (LPL) bei der Differenzierung von SGBS-Präadipozyten denen für primäre humane Präadipozyten aus Fettgewebebiopsien ähneln. Ein qualitativer Vergleich von Proteinen, die aus SGBS-Präadipozyten und differenzierten SGBS-Adipozyten sezerniert wurden, wurde jedoch noch nicht durchgeführt.
Hier führten wir eine umfassende Analyse des Protein- und Expressionsprofils von SGBS-Zellen während des zeitlichen Verlaufs der Adipozytendifferenzierung durch. Um die Adipozytendifferenzierung auf Proteom- und Transkriptomebene zu charakterisieren, wurden menschliche SGBS-Präadipozyten-Zellen wie zuvor beschrieben differenziert. Kurz gesagt, subfluente SGBS-Präadipozyten wurden differenziert in DMEM / Ham’s F12 enthaltend 33 µm Biotin, 17 µm Pantothenat, 10 µg mL Apo‐Transferrin, 20 nm Insulin, 10 nm Hydrocortison und 0,2 nm Trijodthyroxin für 10 Tage. Für die ersten 4 Tage der Differenzierung wurde das Medium zusätzlich mit 25 nm Dexamethason, 500 µm Isobutylmethylxanthin und 2 µm Rosiglitazon supplementiert (für detaillierte Informationen siehe Supporting Information).
Für die Proteomanalyse verwendeten wir die stabile Isotopenmarkierung in Zellkultur (SILAC) in Kombination mit LC‐MS / MS für eine genaue quantitative Proteomanalyse von intrazellulären und sekretierten Proteinen, wie zuvor beschrieben. Alle Experimente wurden in biologischen Triplikaten durchgeführt.
Wir identifizierten 3737 intrazelluläre Proteine, von denen 2602 in mindestens zwei der drei biologischen Replikate zuverlässig quantifiziert wurden. In der Sekretomanalyse wurden 390 Proteine identifiziert, von denen 39 Proteine etablierte adipogene Regulatoren und Modulatoren wie Apolipoprotein E (APOE) und Adiponektin (ADIPOQ) quantifizierten. Insgesamt wurde fast die Hälfte der intrazellulären und extrazellulären Proteine während der Adipozytendifferenzierung differentiell exprimiert (Abbildung 1A).
Die Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen gemäß der GO (gene ontology) database Annotation zeigte eine Anreicherung von zytoplasmatischen Proteinen, aber auch von nukleären und mitochondrialen Proteinen (Abbildung 1B). Es wurde festgestellt, dass 1135 intrazelluläre Proteine und 18 sekretierte Proteine mit einer log2-Faltenänderung von > 0 signifikant reguliert sind.5 und einem p‐Wert von <0,01 (zweischwänziger T‐Test mit ungleicher Varianz) (Abbildung 1C, Tabelle S1, Unterstützende Informationen).
Alle regulierten Proteine wurden nach den annotierten biologischen Prozessen und kanonischen Pfaden sowie ihrer Zuordnung zu Stoffwechselwegen gemäß der Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) gruppiert. Der Großteil der regulierten Proteine ist an Stoffwechselwegen beteiligt, z. B. dem Tricarbonzyklus und der mitochondrialen Atmungskette sowie der Betaoxidation von Fettsäuren (Abbildung 2A). Die Analyse molekularer Proteinfunktionen zeigte eine Anreicherung von Poly (A) RNA‐Bindungsproteinen, Cadherin‐basierten Zell-Zell-Interaktionsproteinen, Oxidoreduktasen, ribosomalen Proteinen und Aktinbindungsproteinen (Abbildung 2B). Die KEGG-Signalweganalyse der differentiell exprimierten Proteine ergab, dass der Aminosäurestoffwechsel, die Zellatmung und der Fettsäurestoffwechsel zu den am stärksten regulierten gehörten (Abbildung 2C). Mehrere Proteine, die am Peroxisom‐Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPARy) -Signalweg beteiligt sind, wurden wie zuvor beschrieben hochreguliert. Zusammengenommen geht die Differenzierung von Adipozyten mit einem hohen Grad an differentieller Proteinexpression einher, wobei die am stärksten betroffenen Wege des Lipid- und Aminosäurestoffwechsels sind.
Für eine umfassende Analyse des Proteoms in Bezug auf das Transkriptom haben wir das Genexpressionsprofil während der Adipogenese durch eine Affymetrix GeneChip-Expressionsanalyse weiter analysiert. Dazu wurden 5 µg Gesamt-RNA für die Microarray-Analyse aufbereitet. Reverse Transkription, in vitro Transkription, Fragmentierung und Hybridisierung der Proben wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden mit HG U133A 2.0-Arrays hybridisiert. Scannen und erste Datenverarbeitung wurden mit der GeneChip-Betriebssoftware ausgeführt. Die Sample Cell Intensity (CEL)-Dateien wurden in GeneSpring GX 7.3 importiert. (Agilent, Palo Alto, USA) unter Verwendung des RMA-Algorithmus für die Rohdatenverarbeitung. Jedes Gen auf jedem Array wurde auf den Median aller Messungen dieses Gens normalisiert. Ein Gen wurde im Allgemeinen als nicht exprimiert angesehen, wenn das rohe Expressionssignal in allen Proben unter 100 lag. Beruhigend ist, dass bei der Hauptkomponentenanalyse die Proben in verschiedene Differenzierungsstufen eingeteilt werden (Abbildung S1, Unterstützende Informationen). Für die statistische Analyse wurden die Proben nach Expressionsprofilen (unterstützende Informationen) in Präadipozyten (n = 3), frühe Differenzierung (n = 3), intermediären Phänotyp (n = 2) und reife Adipozyten (n = 3) eingeteilt. Die durch das Kreuzgenfehlermodell geschätzten Varianzen wurden weiter für statistische Tests verwendet. Die Daten wurden in der Proteomics Identifications Database (PRIDE) (ID PXD012476) und den Geodatensätzen GSE123385 hinterlegt.
Insgesamt wurden 14372 von 22277 getesteten Transkripten zu jedem Zeitpunkt der Differenzierung in SGBS-Zellen exprimiert, die für 9346 einzigartige Proteine kodierten. 1520 davon wurden ebenfalls auf Proteinebene quantifiziert (Tabelle S2, Unterstützende Informationen). 313 Gene (3,3%), die durch 404 (2,8%) Transkripte repräsentiert wurden, wiesen während der Adipozytendifferenzierung > fünffache Expressionsänderungen auf (Tabelle S3, Unterstützende Informationen). Korrelationsanalysen ergaben, dass die Regulation auf Proteinebene in hohem Maße der Transkriptomebene entsprach, wenn Adipozyten mit den Präadipozyten verglichen wurden (Abbildung S2, Unterstützende Informationen).
Als nächstes analysierten wir die typische Adipozytenmarkerexpression während der Adipogenese auf Transkriptom- und Proteomebene, um die Robustheit der molekularen Signatur der Differenzierung zu testen. Wir fanden eine Hochregulierung von Proteinen, die an der Adiponektin‐Expression, der Cholesterinsynthese (Acetyl‐CoA-Acetyltransferase, Lipase E), dem Aminosäuremetabolismus (Aminoacylase) und an Faktoren beteiligt sind, die an der Lipogenese und Lipolyse beteiligt sind (Acetyl-CoA-Carboxylase α und β (ACACA, ACACB)). Zusätzlich wurden typische Marker reifer Adipozyten wie LPL, Fatty acid binding Protein 4 (FABP4), Fatty acid Synthase (FASN), Stearoyl‐CoA-Desaturase und APOE hochreguliert. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass Latexin (LXN), ein Inhibitor der Carboxypeptidase A1, 2 und 4, herunterreguliert wurde. Wir identifizierten die drei Präadipozytenmarker LXN, den Transkriptionsfaktor GATA‐6 (GATA6) und das CX‐C-Motiv Chemokin 6 (CXCL6) sowie die vier reifen Adipozytenmarker LPL, ACACB, APOE und die ATP-Citratlyase (ACLY) (Abbildung S3, Unterstützende Informationen).
Um die Marker-Genexpressionsprofile zu validieren und diejenigen mit der höchsten Adipozytenstatus‐Vorhersagefähigkeit zu identifizieren, führten wir TaqMan RT-PCR in drei unabhängigen SGBS-Differenzierungsexperimenten durch (Unterstützende Informationen). In SGBS-Zellen konnten wir die Genexpressionsprofile aller sieben Markergene validieren und zeigten eine signifikante Regulation während der SGBS-Differenzierung. Fünf Markergene, die mit qPCR in SGBS-Zellen validiert wurden, wurden ebenfalls auf Proteomebene in die gleiche Richtung reguliert (Abbildung 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ und APOE waren in reifen Adipozyten signifikant hochreguliert, während LXN signifikant herunterreguliert war.
Zusammengenommen weisen SGBS-Adipozyten Schlüsselmerkmale und Schlüsselprotein- und mRNA-Signaturen primärer Säugetier-Adipozyten auf, beispielsweise morphologische Eigenschaften sowie molekulare Kennzeichen wie die Aktivierung des PPARy-Signalwegs. Hier zeigen wir, dass auch die Expression mehrerer typischer Adipokine (z.B. ADIPOQ) und reifer Adipozytenmarker (z.B. LPL, FABP4, FASN) bei der SGBS-Zelldifferenzierung induziert wird. Darüber hinaus zeigen die erhaltenen Daten eine metabolische Programmierung während der Adipogenese, wobei die mit dem Fettstoffwechsel verbundenen Wege am stärksten betroffen sind.
Wir erwarten, dass die hier vorgestellten Proteomik‐ und Transkriptomikdaten für die weitere Anwendung und Etablierung von SGBS-Zellen als gut charakterisiertes Modellsystem für die Adipozytendifferenzierung sowie für die Identifizierung von Markergenen von Interesse sein werden, mit denen humane Fettgewebebiopsien hinsichtlich Zusammensetzung und Differenzierungszustand charakterisiert werden können. Unsere Daten können zukünftige Studien erleichtern und leiten, die sich auf die Regulation der Adipogenese und der menschlichen Adipozytensignaturen konzentrieren.