tämä johtaa kolorimetrisiin (absorbanssi) ja fluoresenssimuutoksiin. Resatsuriini on sininen ja fluoresoimaton, kun taas resorufiini on punainen ja erittäin fluoresoiva. Se on herkkä määritys, jos sitä käytetään suuremmilla kuin 5×103 solulla 100 µL: aa kohti, suhteellisen myrkytön ja jos se tehdään huolellisesti, samoja rinnakkaisnäytteitä voidaan seurata useiden aikapisteiden ajan. Tämän määrityksen haittana on se, että se ei ole heamosytometrian kaltainen suora solulaskentatekniikka, koska fluoresenssi-tai absorbanssisignaaliin voivat vaikuttaa sekä muutokset solujen lukumäärässä että solujen aineenvaihdunnassa.
Materiaalit & menetelmät
- 96 Euroopan ECACC-soluviljelmien kokoelman toimittamat Mustat polystyreenimikroplaatit (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH-mikrotiitterilukija
Varhaiskulun ihmisen Osteoblastisolut (HOb 406-05a) kylvettiin substraateille A ja B siten, että näytteen tiheys oli 104. Näytteet pantiin 24 kaivolautaselle, peitettiin 1 ml: lla viljelyainetta ja inkuboitiin yhteensä 17 päivää. Viljelyaine oli McCoyn 5A-kasvualusta, joka sisälsi 10% lämpö inaktivoitua seerumia, 1% glutamiinia ja C-vitamiinia (30 µg/mL).
solujen proliferaation mittaamiseksi kylvettyjä substraatteja inkuboitiin 4 tuntia (pidempiä inkubaatioaikoja voidaan käyttää herkkyyden lisäämiseksi) tuoreella viljelyalustalla, jota täydennettiin 10 tilavuusprosentilla alamarBlue®. Kullekin substraatille käytettiin yhteensä 10 rinnakkaisnäytettä.
inkubaation jälkeen jokaisesta kaivosta siirrettiin 100 µL elatusainetta 96-kuoppaan mustaan polystyreenimikrotiitteriin ja toistettiin 3 kertaa. Fluoresenssi (eksitaatio 530 nm, emissio 590 nm) mitattiin BMG LABTECH-mikrotiitterilukijalla. (Huomautus: Kolorimetristä havaitsemista voidaan seurata absorbanssimittauksilla 570 nm: ssä, kun taas vertailuaallonpituutena käytetään 600 nm: tä. Se on kuitenkin yleensä vähemmän herkkä, koska alamarBlue®: n hapettuneiden ja pelkistettyjen muotojen päällekkäisyys absorbanssilla mitattuna on huomattava.
solujen aiheuttama alamarBlue® – vähennys fluoresenssipäästöjen intensiteettiyksikköinä ilmaistuna mitattiin päivinä 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 ja 17 viljelmäkauden eri näytteistä. AlamarBlue® – valmisteen prosentuaalinen vähennys kussakin tapauksessa laskettiin kaavalla