ez kolorimetriás (abszorbancia) és fluoreszcencia változásokat eredményez. A Resazurin kék és nem fluoreszkáló, míg a resorufin vörös és erősen fluoreszkáló. Ez egy érzékeny vizsgálat, ha 5×103-nál magasabb sejtekkel dolgozik 100 MHz-enként, viszonylag nem mérgező, és feltéve, hogy gondosan végzik, ugyanazok a replikációk több időpontban is követhetők. Ennek a vizsgálatnak az a hátránya, hogy nem olyan közvetlen sejtszámlálási technika, mint a heamocytometria, mert a fluoreszcencia vagy abszorbancia jelet mind a sejtszám változásai, mind a sejtek anyagcseréje befolyásolhatja.
anyagok & módszerek
- 96 well Black polisztirol mikrolemezek (Greiner Bio-One)
- alamarBlue (MORPHOSYS UK)
- BMG LABTECH mikrolemez olvasó
az Ecacc Európai sejttenyészet-gyűjteményből származó korai áthaladású humán oszteoblaszt sejteket (HOb 406-05a) az A és B szubsztrátokra vetettük be mintánként 104-es sűrűséggel. A mintákat egy-egy 24 lyukú lemez kútjába helyeztük, 1 ml táptalajjal letakarva, összesen 17 napig inkubáltuk. A táptalaj a McCoy 5A táptalaja volt, amely 10% hővel inaktivált szérumot, 1% glutamint és C-vitamint (30 Ft/mL) tartalmazott.
a sejtproliferáció mérésére a magozott szubsztrátumokat 4 órán át inkubáltuk (a nagyobb érzékenység érdekében hosszabb inkubációs idő alkalmazható) friss táptalajjal, 10 térfogat% alamarBlue-val kiegészítve. Minden szubsztrátumhoz összesen 10 ismétlést használtunk.
inkubálást követően minden kútból 100 db 6 lyukú fekete polisztirol mikrolemezt helyeztünk át, és 3 alkalommal replikáltuk. A fluoreszcenciát (gerjesztés 530 nm, emisszió 590 nm) BMG LABTECH mikrolemez-olvasón mértük. (Megjegyzés: a kolorimetriás detektálást 570 nm-es abszorbancia mérésekkel lehet ellenőrizni, miközben 600 nm-t használnak referencia hullámhosszként. Azonban általában kevésbé érzékeny, mert az abszorbanciával mérve jelentős átfedés van az alamarBlue oxidált és redukált formái között.
a sejtek által fluoreszcencia-kibocsátási intenzitásegységekben kifejezett alamarBlue-csökkenést napokon mértük 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 17 a tenyésztési időszak különböző minták. Az alamarBlue % – os csökkenését minden esetben a
képlettel számítottuk ki