TESTO
L’arsenico è un cancerogeno umano di classe I che rappresenta un rischio per la salute umana. L’esposizione all’arsenico è legata al cancro della pelle, al cancro della vescica, al diabete, alle malattie cardiovascolari e alle malattie vascolari periferiche (1, 2). L’Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti (EPA) classifica l’arsenico al primo posto nella sua lista Superfund di sostanze pericolose (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
L’arsenico viene rilasciato nell’ambiente per attività geotermica, per dissoluzione di minerali e per attività antropogeniche quali effluenti industriali, combustione di combustibili fossili e uso di pesticidi contenenti arsenico, erbicidi, conservanti del legno e additivi per mangimi (3). Come risultato dell’uso di acqua di irrigazione contaminata da arsenico, l’arsenico si accumula nel riso, la base alimentare per metà della popolazione mondiale (4). La metilazione dell’arsenico è una via di disintossicazione (5, 6). Molti organismi hanno geni che codificano arsenite S-adenosilmetionina (SAM) metiltransferasi (chiamato ArsM nei microbi e AS3MT negli organismi superiori) che biotrasformano come (III) in specie metilate, con trimetilarsina non tossica volatile (7) come prodotto finale(5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida è un batterio Gram-negativo presente nell’acqua e nel suolo, in particolare nella rizosfera ad una densità di popolazione relativamente elevata (10). Questo microrganismo è stato ampiamente studiato come modello per la biodegradazione di composti aromatici come il naftalene (11) e lo stirene (12, 13). I metodi di bonifica convenzionali, come lo scavo del suolo seguito da filtrazione della coagulazione o scambio ionico, sono costosi, distruttivi e non ampiamente utilizzati (14). Sphingomonas desiccabilis e Bacillus idriensis che esprimono arsM possono rimuovere l’arsenico dal terreno contaminato, ma l’espressione da un plasmide limita la loro utilità (15). Specie Pseudomonas hanno la prospettiva di rizoremediation di composti organici (16), ma non sono stati utilizzati per la rimozione di arsenico.
L’obiettivo di questo studio era quello di costruire un ceppo di P. putida KT2440 con il potenziale per la rimozione di arsenico dal terreno contaminato. Abbiamo usato il gene ARSM Chlamydomonas reinhardtii che codifica un ortologo ArsM (CrArsM). In vitro, CrArsM purificato metilato come (III)ad una varietà di specie (vedi Fig. S1A nel materiale supplementare). Dopo 7 h, metilarsenite e dimetilarsenato sono stati prodotti in quantità relativamente uguali. Dopo 14 h, il prodotto era principalmente DMAs(V), con minori quantità di ossido di trimetilarsina e nessun MAs (III). Questi risultati sono coerenti con i passaggi di metilazione sequenziali ai prodotti mono-, di-e trimetilici. Il gas TMA (III)può essere rilevato su filtri impregnati di H2O2 mediante ossidazione a TMA(V) O (vedi Fig. S1B nel materiale supplementare). Questi risultati dimostrano che il CrArsM purificato catalizza tre cicli sequenziali di metilazione As(III) e converte l’arsenico inorganico tossico in arsenici organici meno tossici o non tossici.
Il gene C. reinhardtii arsM dietro il promotore della kanamicina è stato integrato nel cromosoma di P. putida KT2440, che non ha un gene arsM e non metila l’arsenico. Il plasmide PBAM1 di Minitransposon delivery è stato usato come vettore di suicidio per generare integranti stabili in grado di esprimere l’arsM in modo costitutivo. Il gene arsM è stato clonato in pBAM1 (vedi Fig. S2 nel materiale supplementare) e successivamente trasferito da Escherichia coli CC118λpir a P. putida KT2440 mediante coniugazione tripartita con un ceppo helper. Wild-type P. putida ha due operoni arsRBCH cromosomici e può crescere in presenza di 2 mM Come (III), che fornisce un vantaggio competitivo per P. putida in terreno contaminato (10). Questo potrebbe essere un fattore cruciale per sostenere la crescita delle cellule in presenza di popolazioni batteriche indigene (14). Le cellule di P. putida KT2440 che esprimevano CrArsM erano resistenti a 7,5 – 10 mm Come (III) nel mezzo di sale basale liquido M9 (Fig. 1). La biotrasformazione dell’arsenico da parte delle cellule è stata analizzata con 25 µM Come (III) o arseniato (Fig. 2). Dopo 12 ore, P. putida ingegnerizzato biometilato come(III) principalmente in DMAs (V) e, in misura minore, metilarsenato (Fig. 2 BIS). In modo dipendente dal tempo, le cellule ingegnerizzate hanno prodotto gas dimetilarsina e TMA(III), identificati ossidandoli a DMAs(V) e TMA(V)O con H2O2 (Fig. 2 TER). Inoltre, il prodotto della reazione di metilazione è stato quantificato in cellule di P. putida che esprimono il CrArsM. Dopo 48 h, il prodotto principale trovato nel mezzo di coltura era DMAs(V) (57% dell’arsenico totale), con minori quantità di MAs(V) (31%) e ancora meno TMAs(V)O (8%) (Fig. 2 QUATER). Il ceppo transgenico P. putida rapidamente metilato come (V) (Fig. 2A, curva 4). Ci sono due operoni arsRCBH nel cromosoma di P. putida, quindi è ragionevole supporre che la reduttasi ARSC codificata cromosomicamente si sia rapidamente ridotta Come (V) a As(III), il substrato del CrArsM, consentendo al batterio del suolo di metilare sia Come(V) che Come(III).