細胞神経科学におけるフロンティア

はじめに

ニューロトロフィン神経成長因子（NGF）は、標的神経支配、細胞分化および神経生存を含む、発達および成熟した哺乳類の神経系におけるいくつかの重要なプロセスに関与している（Large et al. 1986年;Li et al. ら、１ ９ ９ ５；Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １；Ｌａｄ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003). 成体の脳において、ＮＧＦは、基底前脳コリン作動系の維持および機能において重要な役割を果たす（Ｌａｄ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003). ＮＧＦのレベルは、最も多くの基底前脳コリン作動性突起、すなわち海馬および皮質を受けている領域で最も高い（Ｋｏｒｓｃｈｉｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ５；Ｓｈｅｌｔｏｎ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，１ ９ ８ ６）、および皮質におけるＮＧＦに対する受容体は、大部分が基底前脳皮質皮質突起に限定される（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ８ ８；ｓｈｅｌｔｏｎ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，１ ９ ８ ９）。 ら、１ ９ ８ ８；Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ １；Ｒｏｓｓｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2002). 神経成長因子シグナル伝達は、成人期にコリン作動性皮質頂突起を維持する（Ｃｈｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｄｅｂｅｉｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ９）、およびそれらの軸索の切断後のこれらのニューロンの変性を防止することができる（Ｈｅｆｔｉ、１ ９ ８ ６；Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ０；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1994). さらに、ＮＧＦは、基底前脳培養物からのアセチルコリンの放出を増強する（Ａｕｌｄ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １）およびコリン作動性遺伝子座の表現型制御を介してコリン作動性機能を調節することができる（Ｒｙｌｅｔｔ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ ０ １）。 ら、１ ９ ９ ３；Ｈ Ｕら、１ ９ ９ ４；Ｈ Ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997).

基底前脳コリン作動系は、皮質における学習および経験依存性可塑性に影響を及ぼす(Bakin and Weinberger,1996;Kilgard and Merzenich,1998;Conner et al.、2003、2005）、およびNGFシグナル伝達は、基礎前脳を介した学習および可塑性を支持し、おそらく強化すると仮定されている。 例えば、島皮質におけるＮＧＦ抗体の反復注射を介したＮＧＦシグナル伝達の遮断は、局所コリン作動性神経支配を減少させ、コリン作動性入力の完全性、調節された味覚嫌悪および抑制的回避学習に依存する２つのプロセスの獲得を妨害する（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). Conner et alによる最近の研究。 (2009)は、空間学習と海馬長期増強（LTP）の両方が、海馬へのコリン作動性神経支配の主要な源である中隔核へのNGFの注入後に強化されることを実証した。

Ngfの焦点適用はまた、ラットのバレル皮質における局所ウィスカー表現の急速な拡大を誘導することができる。 この過程は、基底前脳からのコリン作動性突起に依存する（Ｐｒａｋａｓｈ ｅ ｔ ａ ｌ．、1996、2004）、皮質NGFシグナル伝達は、急速なコリン作動性依存性機能再編成を刺激することができることを示唆している。 したがって、基礎前脳コリン作動性細胞に対するその長期的な栄養効果に加えて、NGFはまた、短期的な回路リモデリングに参加することができます。 この「二重作用」仮説は、ＮＧＦの構成的および活性依存的放出機構の存在によって支持される（Ｂｌｏｃｈｌ ａｎｄ Ｔｈｏｅｎｅｎ，１ ９ ９ ５；Ｌｅｓｓｍａｎｎ ｅ ｔ ａ ｌ．,2003),潜在的にNGFの長期栄養および短期調節効果の根底にある,それぞれ. さらに、逆行性（長期）および局所（短期）シグナル伝達経路の両方がNGFについて観察されている（Huang and Reichardt、2003）。

ngfを発現する細胞は、皮質、小脳、海馬、視床、線条体、基底前脳および脳幹において検出されている(Gall and Isackson,1989;Maisonpierre et al. ら，１ ９ ９ ０；Ｉｓａｃｋｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ １；Ｃｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｏｎ，１ ９ ９ ２；Ｈａｙａｓｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ３；Ｍｕｆｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ４；Ｚｈａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007). Ｎｇｆ ｍＲＮＡは、星状細胞および他のグリアで観察されていると報告されているが、大部分の皮質ＮＧＦは、神経細胞によって産生される（Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2001). しかし、皮質でＮＧＦを産生する特定のタイプのニューロンは知られておらず、コリン作動性皮質頂部突起は、皮質の興奮性および抑制性ニューロンの両方を神経支配することが示されている(Zaborszky et al., 1999). 海馬、線条体および基底前脳のような皮質外領域では、ＮＧＦ産生は、主にＧａｂａ作動性抑制性ニューロンに局在する（Ｌａｕｔｅｒｂｏｒｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，１ ９ ９ ３，１ ９ ９ ５；Ｐａｓｃｕａｌら，１ ９ ９ ４，１ ９ ９ ５；Ｐａｓｃｕａｌら， ら、１ ９ ９ ８；Ｂｉｚｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). 皮質におけるNGF産生細胞の同定は、コリン作動性皮質入力の変調の基礎となる潜在的なメカニズム、および皮質可塑性のメカニズムを同定するため 現在の研究では、我々はグルタミン酸作動性ニューロンによる比較的まれな生産で、大人の皮質におけるNGF産生の主なソースとして皮質Gaba作動性細胞のサブセ

材料および方法

すべての被験者は、動物ケアのための制度的ガイドラインに従って治療された。 これまでの研究では、特定の細胞型ngf源の同定を禁止した皮質NGF発現の内因性レベルが低いため、我々は、微小管重合を阻害するために局所コルヒチン注入を行い、それによって細胞体からのNGF輸送を遮断し、産生細胞の相馬における検出可能なNGF抗原の蓄積をもたらす（Schubert et al. ら、１ ９ ７ ２；Ｈｏｋｆｅｌｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ることができると考えられている。 以前の報告は、コルヒチン治療が免疫組織化学的技術を用いたＮＧＦの検出を増加させることを示している（Conner and Varon、1992）。 さらに、現在の研究で使用されたものと同様のコルヒチンレベルは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー BDNFの神経分布における総異常を誘発しない(Conner et al., 1997).

組織調製

成人フィッシャー344ラット（男性4人、女性4人、Harlan Sprague Dawley）を2ml/kgの25mg/mlケタミン、1.3mg/mlキシラジン、0.25mg/mlアセプロマジンカクテルで麻酔し、510μ lのHamilton注射器を用いて、0.5μ l/分の速度で下記の皮質部位で0μ lのコルヒチン（aCSF中の10μ g/μ l）を投与した。 注入後、針は周囲の組織への適切な拡散を可能にするために四分間所定の位置にとどまった。 四つの動物は、ブレグマに+1.2ミリメートル前方（A/P）と±2.5ミリメートル横（M/L）で一次運動皮質（M1）の両側注射を受けました。 溶液の半分を脳の表面より1.6mm下（D/V）に注射し、残りを1.0mmで注射した。5.0、D/V：-7.5および-7.0）、および頭頂皮質（A/P：-3.0、M/L：+5.0、D/V：-1.8および-1.3）。 48時間後、動物を深く麻酔し、250mlの冷たいリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で経心的に灌流し、続いて250mlの冷たい2％パラホルムアルデヒド+0.2％パラベンゾキノンを0.1Mリン酸緩衝液で灌流した。 脳を抽出し、同じ固定剤中で2時間後に固定し、0.1Mリン酸緩衝液中で30％ショ糖を少なくとも72時間4℃で凍結保護した。 コロナ切片（40μ m）は、凍結スライディングミクロトーム上で切断し、さらに免疫組織化学のために処理されるまで、4℃で凍結保護剤（TCS）に保存されました。

二重標識蛍光免疫組織化学

順次二重標識免疫組織化学は、NGFとGaba作動性またはグルタミン酸作動性細胞マーカーのいずれかを発現するニューロンを 遊離浮遊切片を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で洗浄し、０.２ ５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０で透過処理し、次いで、非特異的標識を５％ロバ血清で遮断した。 切片を、ウサギ抗ＮＧＦ抗体（Ｃｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｏｎ，１ ９ ９ ２）中で４℃で７ ２時間インキュベートし、ＴＢＳ中で１：１ ０ ０ ０に希釈し、０.２ ５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０、および５％ロバ血清を添加した。 一次抗体インキュベーションの後、切片をロバ抗ウサギビオチン結合Ｉｇｇ（１：２ ０ ０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）中でインキュベートした。 チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ；Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ Ａ，ＵＳＡ）を適用してＮＧＦシグナルを増幅し、その後切片をＴＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８または５ ９ ４−共役ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）中で１：２ ０ ０ 簡単な洗浄の後、切片を、マウス抗−グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）６ ５（ＧＡＤ−６，Ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｇｉｓｔｒｙ：Ａ Ｂ＿５ ２ ８ ２ ６ ４，１：２ ０ ０ ０；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈ Ｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，Ｉ Ａ，ＵＳＡ）およびマウス抗−ＧＡＤ６ ７（Ａｎｉｔｂｏｄｙｒｅｇｉｓｔｒｙ：Ａ Ｂ＿２ ２ ７ ８ ７ ２ ５，１：１ ５ ０ ０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）、またはマウス抗−ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ（ａ Ｂ−６，Ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｇｉｓｔｒｙ：Ａ Ｂ＿２ ２ ７ ８ ７ ２ ５，１：１ ５ ０ ０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、またはマウス抗ＣＡ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩｉａ（Ｃａｍｋｉｉａ，ＡＮＴＩＢＯＤＹＲＥＧＩＳＴＲＹ：ａ Ｂ＿２ １ ７ ４ ０ １ ３，１：３ ０ ０ ０ ０；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ＴＥＭＥＣＵＬＡ，Ｃ Ａ，Ｕｓａ）、マウス抗ＣＡＬＢＩＮＤＩＮ−Ｄ−２ ８Ｋ（ＡｎｔｉｂｏｄｙＲｅｇｉｓｔｒｙ：Ａ Ｂ＿４ ７ ６ ８ ９ ４，１：１ ５ ０ ０；ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．、1:1500; 最後に、切片を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ９ ４または４ ８ ８結合ロバ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で室温で３時間インキュベートし、再び洗浄し、ガラススライド上に装着し、ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｎ，Ａ Ｌ，ＵＳＡ）中 Ｇａｂａ作動性細胞の同定を最大化するために、ＧＡＤ６ ５およびＧＡＤ６ ７抗体を共インキュベートした。 切片のサブセットを、細胞核の可視化のためにＤａｐｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄで被覆した。

抗体特性評価

本研究で使用されるNGF抗体は、精製されたマウスNGFに対するウサギで飼育された親和性精製ポリクローナルである（Conner and Varon,1992）。 抗体は、精製されたマウスおよび組換えヒトＮＧＦを認識するが、組換えＢＤＮＦまたはＮＴ−３と交差反応しない（Conner and Varon,1996）。 さらに、ラット脳におけるＮＧＦ発現の免疫反応性パターンは、ラット脳におけるｉｎ−ｓｉｔｕ分析から得られたものと密接に一致する（Ｃｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｏｎ，１ ９ ９ ７）。

モノクローナル抗体GAD-65(Developmental Studies Hybridoma Bank,Gad-6)は、ラット脳から精製されたGADタンパク質免疫親和性でマウスを免疫することによって産生された。 ラット脳ホモジネートのウェスタンブロット分析により、抗体はＧＡＤ−６ ５を選択的に認識するが、ＧＡＤ−６ ７は認識しないことが明らかになった（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，１ ９ ８ ８）。 さらなる研究により、ＧＡＤ−６抗体は、ｇａｄ−６ ５のＣ末端のアミノ酸４ ７ ５〜５ ７ １の間に位置するエピトープを認識することが示されている（Ｂｕｔｌｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993).

GAD-67マウスモノクローナル(Millipore,MAB5406,lot: 25010139）は、ヒトGAD-67のアミノ酸残基4-101に対して上昇し、ラット脳のウェスタンブロット分析上の単一の67-kDaバンドを認識した（製造業者の技術情報）。 抗体をＧＳＴ−ＧＡＤ−６ ７融合タンパク質で前インキュベーションすると、脳内に免疫陽性シグナルは生じなかった（Ｉｔｏ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007).

マウスモノクローナル抗CaMKIIa(Millipore,MAB8699,lot:LV1366080)は、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIのαサブユニットを特異的に認識する。 ウェスタンブロット分析は、抗体が50kDaの単一バンドを同定し、リン酸化形態と非リン酸化形態の両方を認識することを示す（Erondu and Kennedy、1985）。＜３ ８ ８ ５＞＜６ ４ ７ ２＞モノクローナル抗ｃａｌｂｉｎｄｉｎ−ｄ−２ ８ｋ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃ９ ８ ４ ８，ｌｏｔ：０ ８ ８ｋ４ ７ ９ ９）は、精製ウシ腎臓ｃａｌｂｉｎｄｉｎ−ｄ−２ ８ｋで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来である。パルバルブミン（製造業者の技術情報）。 ニワトリおよびラットの脳から精製されたカルビンジン−Ｄ−２ ７ｋＤａタンパク質による前吸収は、脳内のカルビンジン免疫染色を排除することが示された（Ｐａｓｔｅｅｌｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1987).＜3885＞＜6472＞抗パルバルブミン（Millipore,MAB1572,lot:LV1378387）をカエル筋肉から精製したパルバルブミンに対して免疫したマウスから採取した。 モノクローナル抗体は最初のCa2+結合部位のエピトープに対して指示され、immunoblotの分析は12kDaの頭脳蛋白質を確認することを示す(製造業者の技術情報)。＜３ ８ ８ ５＞＜９ ２ ０ ６＞共焦点分析＜３ １ ５ ３＞＜６ ４ ７ ２＞画像は、Ｍａｇｎａｆｉｒｅソフトウェアを用いたＯｌｙｍｐｕｓ Ａ Ｘ７ ０（バージョン２.０；Ｋａａｒｌ Ｓｔｏｒｚ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｇｏｌｅｔａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を用いて撮影した。 NGFラベリングは、おそらくコルヒチン拡散の欠如と体細胞NGF蓄積の結果の不在のために、コルヒチン注射部位に実質的に約2ミリメートル前後に減少 すべての10番目のセクション（400μ m）は、皮質領域内で調べた。 細胞を手動で計数し、少なくとも３つの切片を、各皮質領域および被験体当たりの抗体の組み合わせにおいて分析した。 第四の検出不可能なNGF標識のために、側頭領域で評価されたのは三つの動物のみであった。 単一および二重標識細胞を、単一チャネル画像および二重チャネル画像の両方を用いて定量した。 標識された細胞を同定するために、ｄａｐｉ染色組織を評価する際に、サイズ、形態、シグナル対背景、および一致するＤＡＰＩ標識を含むいくつかの基準を使用した。 セクションのサブセットでは、5μ mのzスタックは、標識されたオブジェクトの神経局在を確実にするためにOlympus Fluoview FV1000を使用して収集されました。 二重標識された細胞の絶対数ではなく割合に関心があるため、立体法は使用されなかった。＜3885＞＜6472＞免疫反応性（IR）細胞群あたりの二重標識細胞の割合を各画像フィールドについて決定した。 調べた各皮質領域について平均±標準誤差を計算した。 一方向分散分析（ANOVA）を使用して、皮質領域間の差を評価しました。 ＦｉｓｈｅｒのＨＳＤを事後分析に使用した。 すべての統計分析は、SPSS15.0for Windowsを使用して実行しました。

抗体コントロール

コントロールには、一次抗体の省略、二次抗体の省略、および一次抗体の非特異的抗体（ウサギIgG）への置換が含まれていました。 すべての操作は期待される効果を有し、標識された細胞がそれらの対応する抗体によって真の抗原標識を表すという主張を支持した。

結果

NGF免疫標識

半径1以内に異なるNGF標識が見られた。コルヒチンの皮層の注入の場所からの5つのmm。 これらの領域では、NGF標識は主に細胞体に限定されていた（図1）。 まれに、一つ以上の細胞プロセスも区別することができます。 この1.5mmの半径の外で、NGFの分類は皮質で事実上検出不可能だった。 ＮＧＦ受容体Ｔｒｋａおよびｐ７ ５の皮質発現はコリン作動性皮質繊維に限定されているので、観察されるｎｇｆの標識は、エンドサイトーシスされたＮＧＦを反映することは ら、１ ９ ９ ５；Ｒｏｓｓｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ２；Ｓｈｅｐｈｅｎｓら，２ ０ ０ ３．, 2005). 以前に報告されたように（Ｒｉｂａｋ ｅ ｔ ａ ｌ．,1978),コルヒチン治療は、細胞体だけでなく、神経プロセスにおけるGAD標識を強化しました. コルヒチンはパルバルブミン，カルビンジン，カムキイアの標識に対して検出可能な効果を示さなかった。

図1. 神経の成長因子は抑制的な細胞のマーカーと広く共局在します。 （Ａ）一次運動野および（Ｂ）前頭前野における免疫反応性細胞。 画像は、ＮＧＦ標識された細胞（緑色）がＧＡＤ６ ５／６ ７標識された細胞（赤色）と広範囲に共局在することを示す。 白い矢印は、各皮質領域におけるＮＧＦおよびＧＡＤ６ ５／６ ７の両方についての免疫反応性の例の細胞を示す。 青い矢印は、GAD65/67のみの免疫反応性細胞を示しています。 (C)(B)のホワイトボックス内の領域を拡大した画像。 （Ｄ）（Ｃ）に示す二重標識細胞のＸ−Ｙ−Ｚ再構成。 緑と青の線は、それぞれXZとYZ平面の解剖レベルを示しています。 スケールバー=25μ m。

ngfとGaba作動性の共局在

神経成長因子は、調べた皮質領域にかかわらず、Gaba作動性細胞マーカー GAD65およびGAD67と広範囲に共局在した（図1;表1）。 全体として、NGF標識皮質細胞の91±0.9％もGAD65/67について標識した。 GAD65/67を同時発現するNGF標識細胞の割合は、前頭前野（90.0±1.5％）、モーター（91.7±1.5％）、頭頂（89.6±3.5％）および側頭（93.4±8.1％）皮質（一方向ANOVA;p=0.78）の間でほとんど差を示 逆に、NGFは55±2のみで共局在している。全てのＧＡＤ６ ５／６ ７標識細胞の３％。 NGF産生がGaba作動性ニューロンの特定のサブタイプに制限されていたかどうかを決定するために、我々はNGFとパルバルブミンまたはカルビジンのいずれかの組織を共標識した（図2）。 ＮＧＦ標識された細胞は、両方のマーカーと共局在することが観察された。 しかし、パルバルブミン（67.8±3.6％）とNGF共局在化は、カルビンジン（29.1±3.9％）よりも2倍以上であった。 さらに、NGF-IR細胞は、すべてのパルバルブミン（47.7±4.6％）とカルビンジン（25.7±4.9％）免疫反応性細胞の半分未満を構成した。

図2. Ngfは阻害性ニューロサブクラスマーカーでコラベルした。 運動皮質のスライスは、NGFとパルバルブミンまたはカルビンジンのいずれかについて標識された。 （Ａ）細胞は、ＮＧＦおよびパルバルブミン標識（白い矢印）の広範な重複を示した。 （Ｂ）逆に、ＮＧＦとカルビンジンのコラベリングはあまり一般的ではなかった。 スケールバー=25μ m。

表1. 皮質領域によるNGF-およびGAD65/67-免疫反応性細胞。

神経成長因子発現ニューロンは、すべての皮質層にわたって観察された。 これまでの研究では、皮質層におけるNGF標識ニューロンの不均一な分布が報告されている（Pitts and Miller、2000;Patz and Wahle、2006）。 しかし，ｎｇｆ標識強度はコルヒチン注射部位からの距離の増加とともに減少するため，層による定量分析は現在の研究では行われなかった。

Ngfとグルタミン酸作動性の共局在

CaMKIIaのラベリングは、主に細胞体および近位プロセス内で観察された（図3）。 NGFおよびGaba作動性マーカーで見られる広範な共局在化とは異なり、NGF標識細胞はめったにCaMKIIa標識細胞と共局在化しない（図3;表2）。 合計で、NGF免疫反応性細胞の4.9±1.1％をCaMKIIa抗体と共標識した。 共局在は皮質領域によって有意に異なっていた（一方向ANOVA;p=0.03）;フィッシャーのポストホックは、前頭前野が一次運動皮質（2.4±1.0％;p=0.02）と頭頂皮質（2.9％±1.5;p=0.01）と比較して二重標識NGF細胞（7.6±2.1％）の割合が高かったことを明らかにした。

図3. 神経成長因子は、興奮性細胞マーカー CaMKIIaと最小限に共局在する。 前頭前野の免疫反応性細胞。 細胞は、調べた皮質領域に関係なく、NGF（緑）とCaMKIIa（赤）のためにめったにcolabeledませんでした。 金の矢印は、ＮＧＦのみに対する免疫反応性の細胞の例を示す。 スケールバー=25μ m。

表2. Ngf-およびCaMKIIa-皮質領域による免疫反応性細胞。

CaMKIIaに対する免疫反応性細胞は、NGF抗体によって標識された細胞を大きく上回った。 同時にNGFシグナルを発現するCaMKIIa標識細胞の全体的な割合は2±0.6％であった。 この割合は、一次運動皮質（0.8％±0.3;p=0.001）、頭頂皮質（1.4％±0.6;p=0.01）、および側頭皮質（1.5±0.6％;p=0.01）よりも二重標識NGF/CaMKIIa細胞（3.7±1.1％）の大きな割合を示

考察

今回の研究では、皮質のNGF産生ニューロンの大部分（>90％）がGABAergicであり、全GABAergicニューロンの半分がngfと共局在することが示されている。 対照的に、興奮性ニューロンのマーカーは、NGFとの唯一のまれな共局在を示す。 これらの結果は、本研究で分析された複数の皮質領域全体で一貫しており、NGFは主にラット新皮質の抑制性介在ニューロンによって産生されることを示

NGF免疫反応性は興奮性細胞マーカー（CAMKIIa）とほとんど一致しなかったが、わずかな割合（-5％）は、すべての調べた皮質領域を通じてCaMKIIaの陽性であった。 共焦点解析により，この二重標識は同じ焦点面に由来し，重複する細胞から生じる離散的な信号によるものではないことが確認された。 知られていないが、それはこれらのNGF産生ニューロンは、新皮質における興奮性ニューロンの以前に未確認のサブクラスを表すことが可能である興奮性細胞のような小さな画分におけるNGF発現の機能的意義。

我々の結果は、NGFが線条体、基底前脳、海馬のGABAergic細胞とほぼ独占的に共局在することを示す他の脳領域における以前の研究の知見と一致している（Lauterborn et al. ら，１ ９ ９ ３，１ ９ ９ ５；Ｐａｓｃｕａｌら，１ ９ ９ ４，１ ９ ９ ５；Ｐａｓｃｕａｌら， ら、１ ９ ９ ８；Ｂｉｚｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). したがって、Ｇａｂａ作動性細胞によるＮＧＦ産生は、基底前脳コリン作動性神経支配（基底前脳自体を含む）を受けるすべての標的の一般的な特性であり得る。 これらのコリン作動性神経集団は、それらの表現型および予測の維持のためにＮＧＦを必要とする（Ｒｙｌｅｔｔ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993; Chen et al. ら、１ ９ ９ ７；Ｈ Ｕら、１ ９ ９ ８；Ｈ Ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｄｅｂｅｉｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). 研究全体では、抑制性介在ニューロンは今基底前脳コリン作動性ニューロンのためのNGF栄養の主要なソースとして出てくる。

基底前脳コリン作動性ニューロンは興奮性および抑制性皮質ネットワークの両方を神経支配するが(Zaborszky et al. ることが知られている（Ｈｅｎｓｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｙｋｅｒ，２ ０ ０ ４；Ｙａｚａｋｉ−Ｓｕｇｙａｍａ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ９ ９）。 ら，２ ０ ０ ９；Ｄｏｎａｔｏら，２ ０ ０ ９；Ｄｏｎａｔｏら，, 2013). コリン作動性シグナル伝達は、様々な阻害性亜集団の差動活性化に寄与し、それによって興奮性-阻害性バランスを調節するように思われる（Xiang et al. ら、１ ９ ９ ８；Ｆｒｏｅｍｋｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007). NGFは、それによって、高度に塑性阻害ネットワークとそれらを活性化するコリン作動性入力との間のフィードバック信号として役立つ可能性がある。 実際、ＮＧＦは、コリン作動性依存機構を介して可塑性および行動学習を増強する（Ｐｒａｋａｓｈ ｅ ｔ ａ ｌ． 1996年2004年Gutierrez et al. ら、１ ９ ９ ７；Ｋｏｎｎｅｒら、１ ９ ９ ８；Ｋｏｎｎｅｒら、, 2009). ＮＧＦの活性依存性放出（Ｂｌｏｃｈｌ ａｎｄ Ｔｈｏｅｎｅｎ，１ ９ ９ ５；Ｌｅｓｓｍａｎｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ３）、コリン作動性活性を増加させるＮＧＦの能力と対になっている（Ｒｙｌｅｔｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ３；Ｈ Ｕら、１ ９ ９ ４；Ｈ Ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ａｕｌｄら、１ ９ ９ ８；Ａｕｌｄら、１ ９ ９ ９．,2001),NGFは、強化されたコリン作動性機能を介して活性回路の再編成を促進する可能性があることを示唆している。

今後の研究では、抑制性ニューロンのどのサブクラスがNGFを発現し、この発現が皮質回路にどのように正確に影響するかを同定しようとする。 この目的のために、我々は、ngfが阻害性ニューロンの二つの一般的なマーカー、パルバルブミン（主にバスケットとシャンデリア細胞に関連付けられている）、およ, 2004). 我々の結果は、パルバルブミンによって標識された多くの細胞がNGFを共発現しなかったが、NGFは、主にパルバルブミン免疫反応性細胞で検出されたこと 重要なことに、NGF-IR細胞はまた、阻害性ニューロンの複数のサブクラスがNGFを産生することを示唆し、カルビンジン標識細胞と共局在化しました。

要約すると、ラット新皮質内のNGFは主に抑制性ニューロンによって発現され、系統発生的に古い脳領域から保存され、脳全体に一般化する可能性があ これらの結果から，皮質抑制性介在ニューロンが基底前脳のコリン作動性投射ニューロンの維持に重要な役割を果たすことが示唆された。 Ｇａｂａ作動性介在ニューロンは，調節されたＮＧＦシグナル伝達を介して皮質再編成を促進する可能性がある。

利益相反声明

著者らは、この研究は利益相反の可能性があると解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言

謝辞

NIH(AG10435)、退役軍人局、アルツハイマー協会、Dr.Miriam and Sheldon G.Adelson Medical Research Foundationによって資金提供されています。

補足資料

この記事の補足資料はオンラインで見つけることができます: http://www.frontiersin.org/journal/10.3389/fncel.2014.00220/abstract