Obesity and associated comorbidities, b. v. diabetes, hypertensie en hart-en vaatziekten, vertegenwoordigen de meest voorkomende gezondheidsrisico ‘ s wereldwijd en de prevalentie is meer dan verdubbeld in de laatste 35 jaar en al ontstaan in de kindertijd. Biologisch, voor de vette massa om naast proliferatie te accumuleren, is de differentiatie van fibroblast‐als voorlopers cellen (preadipocytes) in lipide‐gevulde Rijpe adipocytes een belangrijk proces van weefseluitbreiding. Vandaar, is het begrip van de moleculaire gebeurtenissen in dit proces van adipocyte ontwikkeling, differentiatie, en biologie van groeiend belang.
Preadipocyt cellijnen, zoals muizen 3T3-L1, of primaire adipocyten van muizen, ratten of mensen dienen als experimentele modellen voor menselijke adipogenese en worden op grote schaal gebruikt om adipogene regulatoren te karakteriseren en zo substantiële inzichten te verschaffen in de moleculaire processen die de adipogenese reguleren. Niettemin, zijn er sommige beperkingen op de generalizability aan de fysiologie van menselijke adipogenesis, zoals bijvoorbeeld, 3T3‐L1 cellen spontaan vereeuwigd aneuploid embryonale fibroblasten en zij worden afgeleid van muis. Anderzijds, kunnen de primaire menselijke preadipocytes niet tot hoge celaantallen worden uitgebreid zonder hun capaciteit te verliezen om in Rijpe adipocytes te onderscheiden. Bovendien is er een hoge mate van Inter-individuele variabiliteit voor voorbijgaande culturen van cellen van individuen, vandaar beperkend generalizability.
in 2001 werd een humane preadipocyt cellijn afgeleid van een jongen met het Simpson–Golabi–Behmel syndroom (SGBS), wat een geschikt modelsysteem bleek te zijn voor in vitro studies in adipocytenonderzoek. SGBS preadipocytes zijn van menselijke oorsprong, diploïde, differentiëren in een serum vrij, chemisch gestandaardiseerd medium, en staan voor reproduceerbare experimenten toe aangezien de celaantallen grotendeels kunnen worden verhoogd terwijl de cellen hun goede differentiatiecapaciteit voor meer dan 30 generaties behouden. Het SGBS-model is gebruikt voor talrijke studies, zoals het farmacologische testen, genetische invloeden op adipocyte biologie, en adipogenesis of de karakterisering van adipokines. Als bewijs van principe, zijn de uitdrukkingsprofielen van genen zoals GLUT4, leptin, of lipoproteinlipase (LPL) in het differentiëren van sgbs preadipocytes getoond om die voor primaire menselijke preadipocytes van vetweefselbiopten te lijken. Een kwalitatieve vergelijking van eiwitten die worden uitgescheiden uit SGBS preadipocyten en gedifferentieerde SGBS adipocyten is echter nog niet uitgevoerd.
hier hebben we een uitgebreide analyse uitgevoerd van het eiwit-en expressieprofiel van SGBS-cellen gedurende het tijdsverloop van adipocyt-differentiatie. Om de differentiatie van adipocyte op proteome en transcriptome niveau te kenmerken, werden de menselijke cellen van SGBS preadipocytes onderscheiden zoals eerder beschreven. Kort, subconfluent sgbs preadipocytes werden onderscheiden in DMEM / Ham ‘ s F12 die 33 µm biotine, 17 µm pantothenaat, 10 µg mL apo‐transferrine, 20 nm insuline, 10 nm hydrocortison, en 0,2 nm triiodothyroxine gedurende 10 dagen bevatten. Gedurende de eerste 4 dagen van differentiatie werd het medium bovendien aangevuld met 25 nm dexamethason, 500 µm isobutyl‐methylxanthine en 2 µm rosiglitazon (voor gedetailleerde informatie zie ondersteunende informatie).
voor de proteoomanalyse gebruikten we stabiele Isotoopetikettering in celcultuur (SILAC) gecombineerd met LC‐MS/MS voor een nauwkeurige diepgaande kwantitatieve proteoomanalyse van intracellulaire en afgescheiden eiwitten zoals eerder beschreven. Alle experimenten werden uitgevoerd in biologische triplicaten.
we identificeerden 3737 intracellulaire eiwitten waarvan 2602 betrouwbaar werden gekwantificeerd in ten minste twee van de drie biologische replicaten. In secretome analyse, werden 390 proteã nen geà dentificeerd waarvan 39 proteã nen gevestigde adipogenic regelgevers en modulators zoals apolipoprotein E (APOE) en adiponectin (ADIPOQ) werden gekwantificeerd. Globaal, werd bijna de helft van de intracellular en extracellular proteã nen differentieel uitgedrukt tijdens adipocyte differentiatie (figuur 1A).
de analyse van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten volgens de go (gene ontology) database annotatie toonde verrijking van cytoplasmische eiwitten, maar ook van nucleaire en mitochondriale eiwitten (figuur 1B). 1135 intracellulaire eiwitten en 18 uitgescheiden eiwitten werden significant gereguleerd met een log2-voudige verandering van >0.5 en een p-waarde van <0,01 (tweestaart t‐test met ongelijke variantie) (figuur 1C, tabel S1, ondersteunende informatie).
alle gereguleerde eiwitten werden geclusterd volgens de geannoteerde Go biologische processen en canonieke routes en hun toewijzing aan metabole routes zoals voorzien door de Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). De meerderheid van de gereguleerde proteã nen zijn betrokken bij metabolische wegen, bijvoorbeeld, tricarboxylic cyclus en mitochondrial ademhalingsketen, evenals vetzuur bèta‐oxidatie (figuur 2A). De analyse van moleculaire eiwitfuncties toonde een verrijking aan van poly (a) RNA Bindende proteã nen, cadherin‐gebaseerde cel‐cel interactie proteã nen, oxidoreductases, ribosomal proteã NEN, EN actin bindende proteã nen (figuur 2B). Kegg-pathway-analyse van de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten toonde aan dat het aminozuurmetabolisme, de celademhaling en het vetzuurmetabolisme tot de meest significante gereguleerde behoren (figuur 2C). Verscheidene proteã nen betrokken bij de peroxisome proliferator‐geactiveerde receptor (PPARy) signalerende weg werden upregulated, zoals eerder beschreven. Samen genomen, wordt de differentiatie van adipocytes vergezeld van een grote graad van differentiële eiwituitdrukking met lipide en aminozuurmetabolisme verwante wegen die het meest beà nvloed zijn.
voor een uitvoerige analyse van proteome met betrekking tot transcriptome, analyseerden wij verder het profiel van de genuitdrukking tijdens adipogenesis door een Affymetrix Genechipuitdrukkingsanalyse. Voor dit, werden 5 µg van totaal RNA verwerkt voor microarray analyse. Omgekeerde transcriptie, in vitro transcriptie, fragmentatie, en hybridisatie van de monsters werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Samples werden gehybridiseerd tot Hg u133a 2.0 arrays. Scannen en eerste gegevensverwerking werden uitgevoerd met GeneChip besturingssoftware. De voorbeeldcell intensity (CEL) bestanden werden geïmporteerd naar GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) met behulp van het RMA-algoritme voor ruwe gegevensverwerking. Elk gen op elke array werd genormaliseerd tot de mediaan van alle metingen van dat gen. Een gen werd over het algemeen beschouwd als niet uitgedrukt wanneer het ruwe expressiesignaal onder 100 in alle steekproeven was. Bij de analyse van de hoofdcomponenten worden de monsters geruststellend gegroepeerd in verschillende stadia van differentiatie (figuur S1, ondersteunende informatie). Voor statistische analyse werden monsters gegroepeerd in preadipocyten (n = 3), vroege differentiatie (n = 3), intermediair fenotype (n = 2) en volwassen adipocyten (n = 3) volgens expressieprofielen (ondersteunende informatie). De varianties geschat door het Cross‐Gen Error Model werden verder gebruikt voor statistische tests. Gegevens werden gedeponeerd in Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) en GEO data sets GSE123385.
in totaal werden 14372 van de 22277 geteste transcripten uitgedrukt in SGBS-cellen op elk tijdstip van differentiatie, coderend voor 9346 unieke eiwitten. 1520 daarvan werden ook op eiwitniveau gekwantificeerd (tabel S2, ondersteunende informatie). 313 genen (3,3%) vertegenwoordigd door 404 (2,8%) transcripten hadden expressieveranderingen >vervijfvoudigd tijdens adipocyte differentiatie (tabel S3, ondersteunende informatie). Correlatieanalyses toonden aan dat de regelgeving op het eiwitniveau sterk overeenkwam met het transcriptoomniveau dat adipocyten vergelijkt met de preadipocyten (figuur S2, ondersteunende informatie).
vervolgens analyseerden we typische adipocyt marker expressie tijdens adipogenese op het transcriptoom en proteoom niveau voor het testen van de robuustheid van de moleculaire signatuur van differentiatie. We vonden een upregulatie van eiwitten betrokken bij adiponectine expressie, cholesterol synthese (acetyl‐CoA acetyltransferase, lipase E), aminozuurmetabolisme (aminoacylase), en van factoren betrokken bij lipogenese en lipolyse (acetyl‐CoA carboxylase α En β (ACACA, ACACB)). Bovendien werden typische markers van rijpe adipocyten zoals LPL, vetzuurbindend eiwit 4 (FABP4), vetzuursynthase (FASN), stearoyl‐CoA desaturase en APOE upregulated. Daarentegen werd waargenomen dat latexin (LXN), een remmer van carboxypeptidase A1, 2 en 4, downregulated was. Wij identificeerden de drie preadipocyt tellers, LXN, transcriptiefactor GATA‐6 (GATA6), en C‐X‐C motif chemokine 6 (CXCL6), en de vier Rijpe adipocyt tellers LPL, ACACB, APOE, en het ATP citraat lyase (ACLY) (figuur S3, ondersteunende informatie).
om de markergenexpressieprofielen te valideren en de profielen met de hoogste adipocyt‐status te identificeren, hebben we TaqMan RT-PCR uitgevoerd in drie onafhankelijke sgbs-differentiatieexperimenten (ondersteunende informatie). In SGBS-cellen konden we de genexpressieprofielen van alle zeven markergenen valideren en toonden we een significante Regulatie tijdens SGBS-differentiatie. Vijf markergenen gevalideerd met qPCR in SGBS cellen werden ook gereguleerd in dezelfde richting op het proteoom niveau (Figuur 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ, en APOE werden beduidend upregulated in Rijpe adipocytes, terwijl LXN beduidend downregulated was.
samen genomen, vertonen de adipocytes van SGBS zeer belangrijke eigenschappen en zeer belangrijke proteã ne en mRNA handtekeningen van primaire zoogdieradipocytes, bijvoorbeeld, morfologische kenmerken evenals moleculaire stempels zoals de activering van de PPARy-weg. Hier, tonen wij aan dat ook de uitdrukking van verscheidene typische adipokines (b.v., adipoq) en rijpe adipocyte tellers (b. v., LPL, FABP4, FASN) in sgbs celdifferentiatie worden veroorzaakt. Bovendien onthullen de verkregen gegevens een metabolische programmering tijdens adipogenesis, met de verwante wegen van het lipidemetabolisme die het meest worden beà nvloed.
we verwachten dat de proteomica-en transcriptomica-gegevens die hier worden gepresenteerd van belang zijn voor de verdere toepassing en oprichting van SGBS‐cellen als een goed gekarakteriseerd modelsysteem voor adipocytendifferentiatie en voor de identificatie van markergenen, die kunnen worden gebruikt om biopsieën van menselijk vetweefsel te karakteriseren in termen van samenstelling en differentiatietoestand. Onze gegevens kunnen toekomstige studies vergemakkelijken en begeleiden die zich op de verordening van adipogenesis en menselijke adipocyte handtekeningen concentreren.