Frontiers in Cellular Neuroscience

wprowadzenie

neurotrofin nerve growth factor (NGF) bierze udział w kilku krytycznych procesach w rozwijającym się i dojrzałym układzie nerwowym ssaków, w tym unerwieniu celu, różnicowaniu komórek i przeżywalności neuronów (Large et al., 1986; Li et al., 1995; Sofroniew et al., 2001; Lad et al., 2003). W dorosłym mózgu NGF odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu i funkcjonowaniu podstawowego układu cholinergicznego przedmózgowia(Lad i wsp ., 2003). Poziomy NGF są najwyższe w obszarach otrzymujących największą liczbę podstawno-mózgowych projekcji cholinergicznych, a mianowicie hipokamp i kora mózgowa(Korsching et al., 1985; Shelton and Reichardt, 1986), a receptory dla NGF w korze mózgowej są w dużej mierze ograniczone do podstawowych projekcji kortykopetalu przedmózgowia (Kordower et al., 1988; Sofroniew et al., 2001; Rossi et al., 2002). Sygnalizacja czynnika wzrostu nerwów utrzymuje cholinergiczne projekcje kortykopetalu w wieku dorosłym (Chen et al., 1997; Debeir et al., 1999) i może zapobiegać degeneracji tych neuronów po przecięciu ich aksonów (Hefti, 1986; Tuszyński et al., 1990; Kordower et al., 1994). Ponadto, NGF zwiększa uwalnianie acetylocholiny z hodowli podstawowych przodomózgowia(Auld i in., 2001) i może modulować funkcję cholinergiczną poprzez fenotypową kontrolę locus genu cholinergicznego (Rylett et al., 1993; Hu et al., 1997).

podstawowy układ cholinergiczny przedmózgowia wpływa na plastyczność zależną od uczenia się i doświadczenia w korze mózgowej (Bakin and Weinberger, 1996; Kilgard and Merzenich, 1998; Conner et al., 2003, 2005), a sygnalizacja NGF została postawiona hipotezie, aby wspierać i ewentualnie wzmacniać uczenie się i plastyczność za pośrednictwem podstawowego móżdżku. Na przykład blokada sygnalizacji NGF poprzez wielokrotne zastrzyki przeciwciał NGF w korze wyspiarskiej zmniejsza miejscowe unerwienie cholinergiczne i zakłóca nabycie dwóch procesów, które zależą od integralności wejść cholinergicznych, uwarunkowanej awersji smakowej i hamującego uczenia się unikania (Gutierrez et al., 1997). Ostatnie badania przeprowadzone przez Conner et al. (2009) wykazał, że zarówno uczenie przestrzenne, jak i długotrwałe wzmacnianie hipokampa (LTP) są wzmocnione po wlewie NGF do jądra przegrody, głównego źródła unerwienia cholinergicznego hipokampa.

ogniskowe zastosowanie NGF może również wywołać szybką ekspansję lokalnej reprezentacji wąsów w korze baryłkowej szczurów. Proces ten jest zależny od projekcji cholinergicznych z podstawy przedmózgowia (Prakash et al., 1996, 2004), co sugeruje, że korowa sygnalizacja NGF może stymulować szybką, zależną od cholinergicznej reorganizację czynnościową. Tak więc, oprócz długotrwałego działania troficznego na komórki cholinergiczne podstawy przedmózgowia, NGF może również uczestniczyć w krótkotrwałej przebudowie obwodu. Ta hipoteza „podwójnego działania”jest wspierana przez istnienie konstytutywnych i zależnych od aktywności mechanizmów uwalniania NGF (Blochl and Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), potencjalnie leżących u podstaw odpowiednio długoterminowego troficznego i krótkoterminowego efektu modulacyjnego NGF. Ponadto zaobserwowano zarówno wsteczny (długotrwały), jak i lokalny (krótkotrwały) szlak sygnalizacji dla NGF (Huang i Reichardt, 2003).

komórki wyrażające NGF zostały wykryte w korze mózgowej, móżdżku, hipokampie, wzgórzu, prążkowiu, podstawnym móżdżku przednim i pniu mózgu (Gall and Isackson, 1989; Maisonpierre et al., 1990; Isackson et al., 1991; Conner and Varon, 1992; Hayashi et al., 1993; Mufson et al., 1994; Zhang et al., 2007). Chociaż mRNA NGF zaobserwowano podobno w astrocytach i innych glejach, zdecydowana większość korowego NGF jest wytwarzana przez neurony(Sofroniew et al., 2001). Specyficzne typy neuronów wytwarzających NGF w korze mózgowej nie są jednak znane ,a projekcje cholinergiczne kortykopetalu wykazały unerwienie obu pobudzających i hamujących neuronów w korze mózgowej(Zaborszky i in., 1999). W rejonach pozaustrojowych, takich jak hipokamp, prążkowie i podstawy przedmózgowia, produkcja NGF jest głównie zlokalizowana w neuronach hamujących Gabaergicznie (Lauterborn et al., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon et al., 1999). Identyfikacja komórek produkujących NGF w korze mózgowej jest ważna dla identyfikacji potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw modulacji cholinergicznych wejść korowych oraz mechanizmów plastyczności korowej. W obecnym badaniu identyfikujemy podgrupę komórek korowych GABAergicznych jako główne źródło produkcji NGF w korze dorosłej, przy stosunkowo rzadkiej produkcji przez neurony glutaminergiczne.

materiały i metody

wszyscy pacjenci byli leczeni zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Ze względu na niskie endogenne poziomy ekspresji korowego NGF, które zabroniły identyfikacji specyficznych źródeł NGF typu komórkowego w poprzednich badaniach, wykonaliśmy lokalne napary kolchicyny w celu zahamowania polimeryzacji mikrotubul, blokując w ten sposób transport NGF z dala od ciała komórki i powodując akumulację wykrywalnego antygenu NGF w Somie komórek produkujących (Schubert et al., 1972; Hokfelt et al., 1975; Hanson and Edström, 1978; Conner and Varon, 1992). Wcześniejsze doniesienia wykazały, że leczenie kolchicyną zwiększa wykrywanie NGF przy użyciu technik immunohistochemicznych (Conner and Varon, 1992). Ponadto, poziomy kolchicyny podobne do tych stosowanych w obecnym badaniu nie powodują poważnych nieprawidłowości w dystrybucji neuronalnej członka rodziny neurotrofin BDNF (Conner i wsp ., 1997).

preparat tkankowy

osiem dorosłych szczurów Fischera 344 (4 samce, 4 samice; Harlan Sprague Dawley) znieczulono 2 ml/kg ketaminy 25 mg/ml, 1,3 mg/ml ksylazyny i 0,25 mg/ml koktajlu acepromazyny i wstrzyknięto 5.0 µl kolchicyny (10 µg/µl w aCSF) w miejscach korowych wymienionych poniżej z szybkością 0,5 µl/min przy użyciu strzykawki Hamilton o pojemności 10 µl. Po infuzji igła pozostawała na miejscu przez cztery minuty, aby umożliwić odpowiednią dyfuzję do otaczającej tkanki. Cztery zwierzęta otrzymały obustronne zastrzyki w pierwotnej korze ruchowej (M1) przy +1,2 mm przedniej (A/P) i ±2,5 mm bocznej (M/L) do bregma. Połowę roztworu wstrzyknięto 1,6 mm poniżej powierzchni mózgu (D / V), a resztę 1,0 mm. pozostałe cztery zwierzęta otrzymały jednostronne zastrzyki w korze przedczołowej (A/P: +3.0, M/L: +0,5, D / V: -2,3 i -1,8), kora skroniowa (A/P: -6,5, M/L: +5,0, D/V: -7,5 i -7,0) i kora ciemieniowa (A/P: -3,0, M/L: +5,0, D/V: -1,8 i -1,3). Po 48 godzinach zwierzęta poddano głębokiemu znieczuleniu i przezskórnie perfuzowano 250 ml soli fizjologicznej buforowanej zimnym fosforanem (pH 7,4), a następnie 250 ml zimnego 2% paraformaldehydu + 0,2% parabenzochinonu w 0,1 M buforze fosforanowym. Mózgi ekstrahowano, postfiksowano przez 2 godziny w tym samym utrwalaczu i krioprotekowano w 0,1 M buforze fosforanowym zawierającym 30% sacharozy przez co najmniej 72 godziny w temperaturze 4°C. Sekcje koronowe (40 µm) przecięto na zamrażającym mikrotomie ślizgowym i przechowywano w krioprotektancie (TCS) w temperaturze 4°C, aż do dalszego przetworzenia na immunohistochemię.

Dwuznakowa Immunohistochemia Fluorescencyjna

Sekwencyjna dwuznakowa immunohistochemia została użyta do wizualizacji neuronów wyrażających NGF i markerów GABAergicznych lub glutaminergicznych. Sekcje swobodne przemyto roztworem buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS), przepuszczono 0,25% Triton X-100, a niespecyficzne etykietowanie Zablokowano 5% osłem serum. Sekcje inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 4°c w króliczym przeciwciale anty-NGF (Conner i Varon, 1992) rozcieńczonym 1:1000 W TBS, 0,25% Triton X-100 i 5% surowicy osła. Po inkubacji pierwszorzędowych przeciwciał, sekcje inkubowano w IgG sprzężonym z biotyną sprzężoną z osłem anty-króliczym (1: 200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA; PerkinElmer, Waltham, MA, USA) zastosowano do wzmocnienia sygnału NGF, po czym sekcje przemyto w TBS i inkubowano w skoniugowanej streptawidynie Alexa Fluor 488 lub 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rozcieńczono 1:200 przez 3 godziny w 4°C. Po krótkim umyciu sekcje inkubowano zarówno w mysich anty-glutaminianowych dekarboksylazach (GAD) 65 (gad-6, Antybodyregistry:AB_528264, 1:2000; badania rozwojowe Hybridoma Bank,Iowa City, IA, USA), jak i mysich anty-GAD67 (AnitbodyRegistry: AB_2278725, 1:1500; Millipore, Temecula, CA, USA) lub w mysich anty-parwalbuminach (gad-6, Antybodyregistry: AB_528264, 1:2000; badania rozwojowe Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA). antybodyregistry: ab_2174013, 1:30000; Millipore, Temecula, CA, USA), Mysi anty-KALBINDIN-D-28K (antybodyregistry: Ab_476894, 1:1500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), lub mysi anty-CA2+/kalmodulinowa kinaza białkowa IIA (Camkiia, ANTYBODYREGISTRY: ab_2067919, 1: 1500; Na koniec sekcje przemywano, inkubowano w sprzężonym z osłem anty-mysim (Invitrogen) Alexa Fluor 594 lub 488 (Invitrogen) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, ponownie przemywano, montowano na szklanych szkiełkach i pokrywano w Fluoromount-G (Southern Biotech, Birminghan, AL, USA). W celu zmaksymalizowania identyfikacji komórek GABAergicznych, przeciwciała GAD65 i GAD67 inkubowano jednocześnie. Podzbiór sekcji zakrywano w złocie ProLong z DAPI (Invitrogen) w celu wizualizacji jąder komórkowych.

charakterystyka przeciwciał

przeciwciało NGF użyte w tym badaniu jest poliklonalem oczyszczonym z powinowactwem, wyhodowanym u królików przeciwko oczyszczonemu MYSIMU NGF (Conner and Varon, 1992). Przeciwciało rozpoznaje oczyszczony mysi i rekombinowany ludzki NGF, ale nie reaguje krzyżowo z rekombinowanym BDNF lub NT-3 (Conner and Varon, 1996). Ponadto, immunoreaktywny wzór ekspresji NGF w mózgu szczura ściśle odpowiada wzorcowi uzyskanemu z analizy in situ w mózgu szczura (Conner and Varon, 1997).

przeciwciało monoklonalne GAD – 65 (badania rozwojowe Hybridoma Bank, Gad-6) zostało wytworzone przez immunizację myszy oczyszczoną z mózgu szczura immunoaffinity białka gad. Analiza Western blot homogeniatów mózgu szczura wykazała, że przeciwciało selektywnie rozpoznaje GAD-65, ale nie GAD-67 (Chang i Gottlieb, 1988). Dodatkowe badania wykazały, że przeciwciało GAD-6 rozpoznaje epitop zlokalizowany pomiędzy aminokwasami 475-571 C-końca GAD – 65 (Butler i wsp ., 1993).

mysz gad-67 monoclonal (Millipore, MAB 5406, lot: 25010139) został podniesiony przeciwko reszt aminokwasowych 4-101 ludzkiego GAD-67 i rozpoznaje pojedynczy zespół 67-kDa w analizie Western blot mózgu szczura(informacje techniczne producenta). Preinkubacja przeciwciała białkiem fuzyjnym GST-GAD-67 nie spowodowała sygnału immunopozytywnego w mózgu (Ito i wsp., 2007).

mysi monoklonalny anty-CaMKIIa (Millipore, MAB 8699, lot: lv1366080) specyficznie rozpoznaje podjednostkę Alfa zależnej od wapnia/kalmoduliny kinazy białkowej II. Analiza Western blot pokazuje, że przeciwciało identyfikuje pojedyncze pasmo 50 kDa i rozpoznaje zarówno formy fosforylowane, jak i niefosforylowane (Erondu and Kennedy, 1985).

monoklonalna anty-kalbindyna-d-28K (Sigma–Aldrich, c9848, lot: 088k4799) pochodzi od myszy BALB/c immunizowanych oczyszczoną kalbindyną-d-28k nerki bydlęcej. Immunoblotting wykazał, że przeciwciało rozpoznaje pasmo 28-kDa i nie reaguje z podobnymi cząsteczkami, takimi jak kalbindyna-D-9K, kalretynina, lekki łańcuch miozyny i parvalbumin (informacje techniczne producenta). Wykazano, że przedabsorpcja z białkiem kalbindyny-D-27 kDa oczyszczonym z mózgów piskląt i szczurów eliminuje immunostawienie kalbindyny w mózgu (Pasteels et al., 1987).

anty-parwalbuminę (Millipore, MAB 1572, lot: lv1378387) zebrano od myszy immunizowanych przeciwko parwalbuminie oczyszczonej z mięśnia żaby. Przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko epitopowi w pierwszym miejscu wiązania Ca2+, a analiza immunoblotowa wykazuje, że rozpoznaje białko mózgu o masie 12 kDa (Informacja techniczna producenta).

Analiza konfokalna

obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu aparatu Olympus AX70 z oprogramowaniem Magnafire (Wersja 2.0; Karl Storz Imaging, Goleta, CA, USA). Ponieważ znakowanie NGF zostało znacznie zmniejszone o około 2 mm w stosunku do miejsc wstrzyknięcia kolchicyny, prawdopodobnie z powodu braku dyfuzji kolchicyny i wynikającego z tego braku somatycznej akumulacji NGF, analizowano tylko odcinki w obrębie 1,5 mm każdego miejsca wstrzyknięcia kolchicyny. Co dziesiąty odcinek (400 µm) badano w obrębie obszaru kory. Komórki zliczano ręcznie i analizowano co najmniej trzy sekcje w każdym regionie korowym i kombinacji przeciwciał na osobnika. Tylko trzy zwierzęta zostały ocenione w obszarze czasowym z powodu niewykrywalnego oznakowania NGF w czwartym. Pojedyncze i Podwójnie znakowane komórki oznaczano ilościowo za pomocą obrazów jedno – i dwukanałowych. Do identyfikacji oznaczonych komórek wykorzystano kilka kryteriów, w tym Rozmiar, morfologię, sygnał vs.tło i przypadkowe etykietowanie DAPI podczas oceny tkanki barwionej DAPI. W podgrupie sekcji, 5 µm stosy z zebrano za pomocą Olympus Fluoview FV1000 w celu zapewnienia neuronalnej lokalizacji znakowanego obiektu. Ze względu na nasze zainteresowanie proporcją, a nie absolutną liczbą podwójnie znakowanych komórek, nie stosowano metod stereologicznych.

dla każdego pola obrazu oznaczono procent podwójnie znakowanych komórek na grupę komórek immunoreaktywnych (IR). Dla każdego badanego obszaru korowego obliczono średni ± błąd standardowy. Do oceny różnic między regionami korowymi wykorzystano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA). HSD Fishera wykorzystano do analizy post-hoc. Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone przy użyciu SPSS 15.0 Dla Windows.

Kontrola przeciwciał

Kontrola obejmowała pominięcie przeciwciał pierwotnych, pominięcie przeciwciał wtórnych i zastąpienie przeciwciał pierwotnych przeciwciałami niespecyficznymi (królicze IgG). Wszystkie manipulacje przynosiły oczekiwane efekty i wspierały twierdzenie, że znakowane komórki reprezentują prawdziwe oznaczenie antygenu przez odpowiadające im przeciwciała.

wyniki

IMMUNOLABELING NGF

Wyraźne oznakowanie NGF było widoczne w promieniu 1.5 mm od miejsc wstrzyknięcia kory kolchicyny. W tych obszarach znakowanie NGF ograniczało się głównie do Somat komórkowych (rycina 1). Rzadko można wyróżnić jeden lub więcej procesów komórkowych. Poza promieniem 1,5 mm oznakowanie NGF było praktycznie niewykrywalne w korze mózgowej. Ponieważ ekspresja korowa receptorów NGF TrkA i p75 ogranicza się do cholinergicznych włókien kortykopetalu, zaobserwowane etykietowanie NGF jest mało prawdopodobne, aby odzwierciedlało ENDOCYTOZOWANE NGF, ale zamiast tego wskazuje na komórki produkujące NGF(Holtzman i wsp ., 1995; Rossi et al., 2002; Stephens et al., 2005). Jak informowaliśmy wcześniej (Ribak et al., 1978), leczenie kolchicyną zintensyfikowało etykietowanie GAD w ciałach komórkowych, a także w procesach neuronalnych. Kolchicyna nie miała wykrywalnego wpływu na etykietowanie parwalbuminy, kalbindyny lub Kamkiii.

WSPÓŁLOKALIZACJA NGF i Gabaergiczna

czynnik wzrostu nerwów w znacznym stopniu współlokalizował się z markerami komórkowymi Gabaergicznymi GAD65 i GAD67, niezależnie od badanego obszaru kory (rycina 1; Tabela 1). Ogółem, 91 ± 0,9% komórek korowych znakowanych NGF również oznaczonych GAD65/67. Odsetek komórek znakowanych NGF współekspresujących GAD65/67 wykazywał niewielką różnicę między korą przedczołową (90,0 ± 1,5%), motoryczną (91,7 ± 1,5%), ciemieniową (89,6 ± 3,5%) i skroniową (93,4 ± 8,1%) (jednokierunkowa ANOVA; p = 0,78). Odwrotnie, NGF współlokowane tylko 55 ± 2.3% wszystkich komórek znakowanych GAD65/67. Aby ustalić, czy produkcja NGF była ograniczona do określonego podtypu neuronu Gabaergicznego, oznaczyliśmy tkankę dla NGF i parwalbuminy lub kalbindyny (fig. 2). Zaobserwowano kolokalizację komórek oznaczonych NGF za pomocą obu markerów. Jednak kolokalizacja NGF z parwalbuminą (67,8 ± 3,6%) była ponad 2× większa niż z kalbindyną (29,1 ± 3,9%). Ponadto komórki NGF-IR stanowiły mniej niż połowę wszystkich immunoreaktywnych komórek parwalbuminy (47,7 ± 4,6%) i kalbindyny (25,7 ± 4,9%).

neurony wykazujące ekspresję czynnika wzrostu nerwów obserwowano we wszystkich warstwach korowych. Wcześniejsze badania donoszą o nierównomiernym rozkładzie neuronów znakowanych NGF w warstwach korowych (Pitts and Miller, 2000; Patz and Wahle, 2006). W obecnym badaniu nie przeprowadzono jednak analizy ilościowej według warstw, ponieważ intensywność znakowania NGF zmniejszała się wraz ze wzrostem odległości od miejsca wstrzyknięcia kolchicyny.

WSPÓŁLOKALIZACJA NGF i Glutaminergiczna

znakowanie Kamkiii obserwowano głównie w somacie komórkowym i procesach proksymalnych (ryc. 3). W przeciwieństwie do rozległej Ko-lokalizacji obserwowanej z markerami NGF i Gabaergicznymi, komórki znakowane NGF rzadko Ko-zlokalizowane z komórkami znakowanymi CaMKIIa (ryc. 3; Tabela 2). Łącznie, 4,9 ± 1,1% komórek immunoreaktywnych NGF było znakowanych przeciwciałami CaMKIIa. Współlokalizacja znacząco różniła się w zależności od regionu korowego (jednokierunkowa ANOVA; p = 0,03); post hoc Fishera ujawnił, że kora przedczołowa miała większy odsetek podwójnie znakowanych komórek NGF (7,6 ± 2,1%) w porównaniu do pierwotnej kory ruchowej (2,4 ± 1,0%; p = 0,02) i kory ciemieniowej (2,9% ± 1,5; p = 0,01).

komórki immunoreaktywne dla CaMKIIa znacznie przewyższają liczby oznaczane przez przeciwciała NGF. Ogólny odsetek komórek znakowanych CaMKIIa jednocześnie wyrażających sygnał NGF wynosił 2 ± 0,6%. Odsetek ten różnił się znacząco w zależności od regionu (jednokierunkowa ANOVA p = 0,003), przy czym kora przedczołowa wykazywała większy odsetek podwójnie znakowanych komórek NGF / CaMKIIa (3,7 ± 1,1%) niż pierwotna kora ruchowa (0,8% ± 0,3; p = 0,001), kora ciemieniowa (1,4% ± 0,6; p = 0,01) i kora skroniowa (1,5 ± 0,6%; p = 0,01)..

dyskusja

obecne badanie pokazuje, że zdecydowana większość (> 90%) neuronów wytwarzających NGF kory jest Gabaergiczna, podczas gdy połowa wszystkich neuronów GABAergicznych kolokalizuje się z NGF. Natomiast markery neuronów pobudzających wykazują tylko rzadką Ko-lokalizację z NGF. Wyniki te były spójne w wielu regionach korowych analizowanych w tym badaniu, co wskazuje, że NGF jest wytwarzany głównie przez interneurony hamujące w Korie nowej szczura.

chociaż immunoreaktywność NGF rzadko pokrywała się z markerami pobudzającymi komórki (CAMKIIa), niewielki odsetek (~5%) był dodatni dla CaMKIIa we wszystkich badanych regionach korowych. Analiza konfokalna potwierdziła, że to podwójne etykietowanie pochodzi z tej samej płaszczyzny ogniskowej i nie było spowodowane dyskretnym sygnałem wynikającym z nakładających się komórek. Funkcjonalne znaczenie ekspresji NGF w tak małej części komórek pobudzających nie jest znane, ale jest możliwe, że te neurony produkujące NGF reprezentują wcześniej niezidentyfikowaną podklasę neuronów pobudzających w Korie nowej.

nasze wyniki są zgodne z wynikami wcześniejszych badań w innych regionach mózgu wykazujących, że NGF współlokalizuje się prawie wyłącznie z komórkami Gabaergicznymi w prążkowiu, podstawnym przodomózgowiu i hipokampie (Lauterborn et al., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon et al., 1999). Tak więc produkcja NGF przez komórki GABAergiczne może być ogólną własnością wszystkich celów otrzymujących podstawowe unerwienie cholinergiczne przedmózgowia (w tym samego podstawowego przedmózgowia). Te populacje neuronów cholinergicznych wymagają NGF do utrzymania ich fenotypu i projekcji (Rylett et al., 1993; Chen et al., 1997; Hu et al., 1997; Debeir et al., 1999). W różnych badaniach interneurony hamujące stają się obecnie głównym źródłem trofizmu NGF dla podstawowych neuronów cholinergicznych przedmózgowia.

chociaż podstawowe neurony cholinergiczne przedmózgowia unerwiają zarówno pobudzające, jak i hamujące sieci korowe (Zaborszky i wsp ., 1999), źródło wsparcia troficznego pochodzi głównie z populacji hamującej, która odgrywa kluczową rolę w mediowaniu plastyczności w obwodach korowych (Hensch and Stryker, 2004; Yazaki-Sugiyama et al., 2009; Donato et al., 2013). Wydaje się, że sygnalizacja cholinergiczna przyczynia się do różnicowej aktywacji różnych subpopulacji hamujących, modulując w ten sposób równowagę pobudzająco-hamującą (Xiang et al., 1998; Froemke et al., 2007). NGF może zatem służyć jako sygnał sprzężenia zwrotnego między wysoce plastycznymi sieciami hamującymi a aktywującymi je wejściami cholinergicznymi. Rzeczywiście, NGF zwiększa plastyczność i uczenie się behawioralne poprzez mechanizmy zależne od cholinergiczne (Prakash et al., 1996, 2004; Gutierrez et al., 1997; Conner et al., 2009). Zależne od aktywności uwalnianie NGF (Blochl and Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), w połączeniu ze zdolnością NGF do zwiększania aktywności cholinergicznej (Rylett et al., 1993; Hu et al., 1997; Auld et al., 2001), sugeruje, że NGF może promować reorganizację aktywnych obwodów poprzez zwiększoną funkcję cholinergiczną.

przyszłe badania będą próbowały zidentyfikować, które podklasy neuronów hamujących wyrażają NGF i jak ta ekspresja precyzyjnie wpływa na obwody korowe. W tym celu podjęliśmy wstępne kroki w celu ustalenia, czy NGF współlokalizowane z dwoma wspólnymi markerami neuronów hamujących, parvalbumin (głównie związane z komórkami kosza i żyrandola)i calbindin (związane z licznymi typami komórek hamujących; McBain i Fisahn, 2001; Markram et al., 2004). Nasze wyniki pokazują, że NGF wykryto przede wszystkim w komórkach immunoreaktywnych parvalbumin, chociaż wiele komórek znakowanych przez parvalbumin nie współwystępowało NGF. Co ważne, komórki NGF-IR również kolokalizują się z komórkami znakowanymi kalbindyną, co sugeruje, że więcej niż jedna podklasa neuronów hamujących wytwarza NGF.

podsumowując, w obrębie nowej kory szczura NGF jest przede wszystkim wyrażany przez neurony hamujące, właściwość, która wydaje się być zachowana z filogenetycznie starszych obszarów mózgu i która może uogólniać się na mózg jako całość. Nasze wyniki sugerują, że interneurony hamujące korę odgrywają istotną rolę w utrzymaniu cholinergicznych neuronów projekcyjnych podstawy przedmózgowia. W ten sposób interneurony GABAergiczne mogą promować reorganizację korową poprzez regulowaną sygnalizację NGF.

Oświadczenie o konflikcie interesów

autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

podziękowania

finansowane przez NIH (AG10435), Veterans Administration, Alzheimer ’ s Association i dr Miriam i Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation.

Materiały uzupełniające

Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć w Internecie pod adresem: http://www.frontiersin.org/journal/10.3389/fncel.2014.00220/abstract