otyłość i związane z nią choroby współistniejące, na przykład cukrzyca, nadciśnienie i choroby sercowo-naczyniowe, stanowią najczęstsze zagrożenia dla zdrowia na całym świecie, a częstość występowania wzrosła ponad dwukrotnie w ciągu ostatnich 35 lat i pojawiła się już w dzieciństwie. Biologicznie, aby masa tłuszczowa gromadziła się poza proliferacją, różnicowanie komórek prekursorowych podobnych do fibroblastów (preadipocytów) w Dojrzałe adipocyty wypełnione lipidem jest głównym procesem ekspansji tkanek. Stąd zrozumienie molekularnych wydarzeń w tym procesie rozwoju, różnicowania i biologii adipocytów ma coraz większe znaczenie.
linie komórkowe Preadipocytów, takie jak mysie 3T3‐L1, lub pierwotne adipocyty od myszy, szczurów lub ludzi służą jako eksperymentalne modele dla ludzkiej adipogenezy i są szeroko stosowane do charakteryzowania regulatorów adipogennych, a tym samym zapewniają znaczny wgląd w procesy molekularne regulujące adipogenezę. Niemniej jednak, tam są pewne ograniczenia na generalizability fizjologia ludzki adipogeneza, jak na przykład, 3T3-L1 komórki są spontanicznie uwiecznione aneuploid embrionalny fibroblasts i pochodzą one od myszy. Z drugiej strony, pierwotne ludzkie preadipocyty nie mogą być rozszerzone do wysokiej liczby komórek bez utraty ich zdolności do różnicowania się w Dojrzałe adipocyty. Ponadto istnieje wysoki stopień zmienności międzyosobniczej dla kultur przejściowych z komórek osobników, co ogranicza uogólnienie.
w 2001 r.powstała ludzka linia komórkowa preadipocytów pochodząca od chłopca z zespołem Simpsona–Golabi–Behmela (SGBS), która okazała się odpowiednim systemem modelowym do badań in vitro w badaniach nad adipocytami. PREADIPOCYTY SGBS są pochodzenia ludzkiego, diploidalne, różnicują się w wolnym od surowicy, chemicznie standaryzowanym podłożu i pozwalają na powtarzalne eksperymenty, ponieważ liczba komórek może być znacznie zwiększona, podczas gdy komórki zachowują swoją dobrą zdolność różnicowania przez ponad 30 pokoleń. Model SGBS został wykorzystany w wielu badaniach, takich jak badania farmakologiczne, genetyczne wpływy na biologię adipocytów i adipogenezę lub charakterystykę adipokin. Jako dowód Zasady, profile ekspresji genów jak GLUT4, leptyna, lub lipaza lipoproteinowa (LPL) w różnicowaniu SGBS preadipocytes wykazano przypominać te dla pierwotnych ludzkich preadipocytes z tkanki tłuszczowej biopsji. Nie przeprowadzono jednak jakościowego porównania białek wydzielanych z preadipocytów SGBS i zróżnicowanych adipocytów SGBS.
tutaj przeprowadziliśmy kompleksową analizę profilu białek i ekspresji komórek SGBS w czasie różnicowania adipocytów. W celu scharakteryzowania różnicowania adipocytów na poziomie proteomu i transkryptomu, ludzkie komórki PREADIPOCYTÓW SGBS różnicowano w sposób opisany wcześniej. Krótko mówiąc, subfluentne PREADIPOCYTY SGBS różnicowano w F12 dmem / Ham zawierającym 33 µm biotyny, 17 µm pantotenianu, 10 µg mL apo‐transferryny, 20 nm insuliny, 10 nm hydrokortyzonu i 0,2 nm trijodotyroksyny przez 10 dni. Przez pierwsze 4 dni różnicowania pożywkę uzupełniano dodatkowo 25 nm deksametazonem, 500 µm izobutylo‐metyloksantyny i 2 µm rozyglitazonu (szczegółowe informacje znajdują się w informacjach uzupełniających).
do analizy proteomu użyliśmy stabilnego znakowania izotopowego w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu z LC‐MS/MS w celu dokładnej, pogłębionej ilościowej analizy proteomu wewnątrzkomórkowych i wydzielanych białek, jak opisano wcześniej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w biologicznych trójplikatach.
zidentyfikowaliśmy 3737 białek wewnątrzkomórkowych, z których 2602 wiarygodnie oznaczono ilościowo w co najmniej dwóch z trzech replikatów biologicznych. W analizie secretome zidentyfikowano 390 białek, z czego 39 białek zawierało ustalone regulatory adipogenne i modulatory, takie jak apolipoproteina E (APOE) i adiponektyna (ADIPOQ) oznaczono ilościowo. Ogólnie prawie połowa białek wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych ulegała ekspresji różnicowej podczas różnicowania adipocytów (Fig.1a).
analiza subkomórkowej lokalizacji białek według adnotacji bazy danych GO (Gene ontology) wykazała wzbogacenie białek cytoplazmatycznych, ale także białek jądrowych i mitochondrialnych (Fig.1B). Stwierdzono, że 1135 białek wewnątrzkomórkowych i 18 białek wydzielanych podlega znaczącej regulacji z Log2-krotną zmianą >0.5 i wartość p <0,01 (dwuogonowy test t z nierówną wariancją) (rysunek 1C, tabela S1, Informacje uzupełniające).
wszystkie regulowane białka zostały zgrupowane zgodnie z opisanymi procesami biologicznymi GO i ścieżkami kanonicznymi, a także ich przypisaniem do szlaków metabolicznych, jak zapewnia encyklopedia genów i genomów z Kioto (KEGG). Większość regulowanych białek bierze udział w szlakach metabolicznych, na przykład w cyklu trikarboksylowym i mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, a także w beta‐utlenianiu kwasów tłuszczowych (Fig.2A). Analiza funkcji białek molekularnych wykazała wzbogacenie białek wiążących Poli(a) RNA, białek interakcji komórka‐komórka opartych na cadherinie, oksydoreduktaz, białek rybosomalnych i białek wiążących aktynę (Fig.2b). Analiza szlaku KEGG różnicowo wyrażonych białek wykazała, że metabolizm aminokwasów, oddychanie komórkowe i metabolizm kwasów tłuszczowych były jednymi z najistotniej regulowanych (Fig.2C). Kilka białek biorących udział w szlaku sygnałowym receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARy) zostało wyregulowanych w górę, jak opisano wcześniej. Razem, różnicowaniu adipocytów towarzyszy duży stopień ekspresji białka różnicowego z lipidów i aminokwasów metabolizmu związanych szlaków jest najbardziej dotkniętych.
w celu kompleksowej analizy proteomu w stosunku do transkryptomu, dalej analizowaliśmy profil ekspresji genu podczas adipogenezy za pomocą analizy ekspresji GeneChip Affymetrix. W tym celu przetworzono 5 µg całkowitego RNA do analizy mikromacierzy. Odwrotną transkrypcję, transkrypcję in vitro, fragmentację i hybrydyzację próbek przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki hybrydyzowano do macierzy HG U133A 2.0. Skanowanie i pierwsze przetwarzanie danych zostało wykonane za pomocą oprogramowania operacyjnego GeneChip. Pliki intensywności komórek próbki (CEL) zostały zaimportowane do GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) wykorzystanie algorytmu RMA do przetwarzania danych surowych. Każdy gen na każdej tablicy był znormalizowany do mediany wszystkich pomiarów tego genu. Gen był ogólnie uważany za nieekspresowany, gdy surowy sygnał ekspresji był poniżej 100 we wszystkich próbkach. Co pocieszające, w analizie głównych składników próbki są pogrupowane w różne etapy różnicowania (rysunek S1, Informacje uzupełniające). Do analizy statystycznej próbki pogrupowano na preadipocyty (N = 3), wczesne różnicowanie (n = 3), fenotyp pośredni (n = 2) i dojrzałe adipocyty (N = 3) zgodnie z profilami ekspresji (informacje pomocnicze). Wariancje oszacowane przez model błędu krzyżowego genu zostały następnie wykorzystane do badań statystycznych. Dane zostały zdeponowane w bazie danych Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) i zestawach danych GEO GSE123385.
w sumie 14372 z 22277 badanych transkryptów uległo ekspresji w komórkach SGBS w dowolnym momencie różnicowania, kodując 9346 unikalnych białek. 1520 z nich oznaczono również na poziomie białka (tabela S2, Informacje uzupełniające). 313 genów (3,3%) reprezentowanych przez 404 transkrypty (2,8%) miało zmiany ekspresyjne >pięciokrotnie podczas różnicowania adipocytów (tabela S3, Informacje uzupełniające). Analizy korelacji wykazały, że regulacja na poziomie białka w dużym stopniu odpowiada poziomowi transkryptomu porównującemu adipocyty z preadipocytami (rysunek S2, Informacje uzupełniające).
następnie przeanalizowaliśmy typową ekspresję markera adipocytów podczas adipogenezy na poziomie transkryptomu i proteomu w celu sprawdzenia odporności molekularnej sygnatury różnicowania. Odkryliśmy wzrost regulacji białek zaangażowanych w ekspresję adiponektyny, syntezę cholesterolu (acetylotransferaza acetylo‐CoA, lipaza E), metabolizm aminokwasów (aminoacylaza) oraz czynniki zaangażowane w lipogenezę i lipolizę (acetylo‐CoA karboksylaza α i β (ACACA, ACACB)). Dodatkowo podwyższono typowe markery dojrzałych adipocytów, takie jak LPL, białko wiążące kwasy tłuszczowe 4 (FABP4), syntaza kwasów tłuszczowych (FASN), desaturaza stearoilowo‐CoA i APOE. W przeciwieństwie do tego, lateksyna (Lxn), inhibitor karboksypeptydazy A1, 2 i 4, była obniżana. Zidentyfikowaliśmy trzy markery preadipocytów, Lxn, czynnik transkrypcyjny GATA-6 (GATA6) i motyw C‐X‐C chemokine 6 (CXCL6) oraz cztery Dojrzałe markery adipocytów LPL, ACACB, APOE i LIAZĘ CYTRYNIANOWĄ ATP (ACLY) (rysunek S3, Informacje uzupełniające).
aby zweryfikować profile ekspresji genów markerowych i zidentyfikować osoby o najwyższej zdolności przewidywania statusu adipocytów, wykonaliśmy TaqMan RT‐PCR w trzech niezależnych eksperymentach różnicowania SGBS (informacje pomocnicze). W komórkach SGBS byliśmy w stanie zweryfikować profile ekspresji genów wszystkich siedmiu genów markerowych i wykazaliśmy znaczącą regulację podczas różnicowania SGBS. Pięć genów markerowych zwalidowanych qPCR w komórkach SGBS również regulowano w tym samym kierunku na poziomie proteomu (Fig.3). ACACB, acyl, ADIPOQ, i APOE znacząco upregulated w dojrzałych adipocytes, podczas gdy Lxn znacząco downregulated.
razem wzięci, SGBS adipocytes eksponują kluczowymi cechami i kluczowymi proteinami i mRNA podpisami pierwszorzędowymi ssak adipocytes, na przykład, morfologicznymi właściwościami as well as molecular hallmarks jak aktywacja PPARy szlak. Tutaj, my pokazywać że także wyrażenie kilka typowy adipokines (e.g., ADIPOQ) i dojrzały adipocyte markery (e. g., LPL, FABP4, FASN) indukować w SGBS komórka różnicowanie. Ponadto Uzyskane dane ujawniają programowanie metaboliczne podczas adipogenezy, przy czym szlaki metaboliczne związane z metabolizmem lipidów są najbardziej dotknięte.
oczekujemy, że przedstawione tutaj dane proteomiczne i transkryptomiczne będą interesujące dla dalszego zastosowania i ustanowienia komórek SGBS jako dobrze scharakteryzowanego modelu różnicowania adipocytów, jak również dla identyfikacji genów markerowych, które mogą być wykorzystane do scharakteryzowania biopsji ludzkiej tkanki tłuszczowej pod względem składu i stanu różnicowania. Nasze dane mogą ułatwić i ukierunkować przyszłe badania koncentrujące się na regulacji adipogenezy i ludzkich sygnatur adipocytów.