Epstein-Barr Vírus (EBV-) Imortalizado Lymphoblastoid Linhas de Células (LCLs) Expressar Alto Nível de CD23, mas de Baixo CD27 para Apoiar o Seu Crescimento

Resumo

vírus de Epstein-Barr (EBV) é um dos humanos comuns herpesvirus tipos no mundo. O EBV é conhecido por infectar mais de 95% dos adultos no mundo. O vírus infecta principalmente linfócitos B e pode imortalizar e transformar as células em linhas celulares linfoblastóides Portadores de EBV (LCLs). Estudos limitados têm sido focados em caracterizar a expressão de marcador de superfície dos LCLs imortalizados. Este estudo demonstra a geração de 15 LCLs a partir de dezasseis doentes com artrite reumatóide (ar) e um voluntário saudável utilizando EBV derivado do B95-8 marmoset. A taxa de sucesso da geração LCL foi de 88,23%. Todos os CD19+ LCLs expressos CD23 (16,94-58,9%) e CD27 (15,74-80,89%) na superfície celular. Os nossos dados demonstraram duas categorias distintas de LCLs (crescimento rápido e lento) (p<0,05) com base no seu tempo de duplicação. O LCLs de crescimento lento mostrou um nível CD23 mais baixo (35,28%) em comparação com LCLs de crescimento rápido (42,39%). Em contraste, o lcls de crescimento lento mostrou maior porcentagem tanto em CD27 sozinho e CD23+CD27+ em combinação. Em geral, estes achados podem sugerir as correlações da expressão celular CD23 e CD27 com a taxa de proliferação das LCLs geradas. Aumentar a expressão do CD23 pode desempenhar um papel na imortalização do EBV de células B e no crescimento e manutenção do EBV transformado LCLs, enquanto a expressão do CD27 pode ter efeitos inibitórios sobre a proliferação do LCL. São necessárias investigações adicionais a estas especulações.

1. Introdução o vírus Epstein-Barr (EBV) infectou mais de 95% dos adultos em todo o mundo . O EBV destina-se principalmente e infecta células B seguidas de células epiteliais e, em menor grau, células T CD4 . Os viriões infecciosos são produzidos após a replicação lítica em células B e células epiteliais. Após o ciclo lítico, a latência EBV segue e persiste nas células B infectadas para o resto da vida do indivíduo . O EBV causa principalmente mononucleose infecciosa e também está intimamente associado com doenças malignas linfóides e epiteliais como linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, carcinoma nasofaríngeo e câncer gástrico .

EBV infecta células B e pode imortalizar as células B e formar LCLs de crescimento a longo prazo que expressam consistentemente os vírus . Este método tem sido usado em laboratórios para imortalizar certas células B derivadas do sangue humano, que pode ser mais tarde usado como um modelo de cultura para vários estudos, incluindo o rastreio de bibliotecas de drogas em grande escala, estudo de vacinas, e estudos biológicos de alto rendimento . Entre todos, EBV produzido a partir de B95-8, uma linha de células marmoset, parece ser a mais comum e potente fonte EBV para imortalização de células B. Nas últimas décadas, os pesquisadores têm se esforçado para melhorar o método de imortalização e sua eficiência . Recentemente, tem sido demonstrado que com uma pequena modificação, LCLs pode ser gerado a partir de um pequeno volume de sangue periférico tão baixo como 0, 1 mL . Esta conclusão é particularmente útil numa circunstância em que o volume da amostra é limitado.Estudos anteriores relataram que as células imunitárias, particularmente as células B e os seus subconjuntos, desempenham um papel fundamental na patogénese da AR . Apesar do sucesso da imortalização EBV de células B, pouco foi feito sobre a caracterização de LCLs e sua comparação com as células B parentais. Neste estudo, demonstrámos que o EBV podia imortalizar eficazmente as células B do sangue periférico dos doentes com ar e formar LCLs. Examinamos então os níveis de expressão de vários marcadores de subpopulação de células B, incluindo CD23 e CD27 em ambos LCLs e suas células B parentais. Estas sub-populações de células B foram previamente associadas à apresentação clínica de doentes com ar. Por exemplo, células B elevadas que expressam CD23 foram detectadas em doentes com ar e podem ser bloqueadas por anticorpos monoclonais . Do mesmo modo, foi também rapidamente detectada uma quantidade aumentada de células B CD27+IgD – memory em doentes com ar activo . Por outro lado, Hu e colegas de trabalho demonstraram que as células CD27+ B correlacionaram-se negativamente com a actividade da doença de ar, tendo-se verificado que estavam comprometidas nos doentes .

neste estudo, procurámos avaliar o nível de expressão das células B CD23 e / ou CD27 das células B das células PBMCs e LCL derivadas de doentes com ar. Também investigamos o nível de expressão dos CD23 e CD27 em relação ao crescimento celular das LCLs.

2. Materiais e métodos

2.1. Amostras de doentes

5 ml de sangue periférico de dezasseis doentes com ar (Quadro 1) foram colhidas no Centro Médico de Sunway, na Malásia, ao abrigo de um código de aprovação ética de 011/2017/ER. As CPSP foram isoladas utilizando o método Ficoll-Paque (GE Healthcare). Brevemente, o sangue recolhido no tubo EDTA foi diluído 1 a 1 com solução salina estéril de tampão fosfato (PBS) e colocado em camadas numa solução Ficoll-Paque num tubo de centrifugação fresco. O tubo foi centrifugado a 400 xg durante 40 minutos à temperatura ambiente, com baixa aceleração e “travão desligado”. A camada superior que é o plasma foi coletada e aliquotada antes de armazenar a -80 ° C. A camada buffy contendo PBMCs foi coletada usando pipeta Pasteur de 3 ml e transferida para um tubo de centrifugação fresco. As células foram lavadas duas vezes com PBS seguido de meio RPMI contendo 10% de soro Fetal bovino (FBS), antes de serem criopreservadas em 10% de DMSO e armazenadas em tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. 5 ml de sangue foi doado por um voluntário saudável como controle. As CMSP e o plasma foram processados e armazenados como descrito acima. A data do diagnóstico, amostragem de sangue, pbmcs criopreservation, e imortalização EBV são mostrados em materiais suplementares (disponível aqui).

2.2. Análise ao sangue e cálculo da actividade da doença

2, 3. EBV Immortalization

B95-8 marmoset derived EBV sobrenadant was a kind gift from Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia. Células B do sangue periférico do paciente foram imortalizadas usando o sobrenadante EBV concentrado, como descrito anteriormente . A tabela em materiais complementares mostra a data de isolamento e criopreservação PBMC, estabelecimento LCLs, e a duração de PBMCs criopreservados armazenados em tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Brevemente, um frasco de PBMC previamente criopreservado foi descongelado e o número de células foi determinado. As células foram ajustadas a 2 x 106 / mL utilizando sobrenadante EBV descongelado e incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 num balão T25 em pé. No dia seguinte, adicionou-se ao frasco um meio de transformação (RPMI 1640 + 20% de FBS + 200ng/ml de ciclosporina). As células infectadas pelo EBV foram observadas sob o microscópio para procurar LCL transformadas em roseta em aglomerados. Foram utilizados LCLs nas passagens 3-6 para a análise da citometria de fluxo e para o ensaio de proliferação celular.

2.4. Citometria de fluxo, Análise de

Três cores citometria foi realizada no citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizando anticorpos monoclonais identificação de antigénios de superfície de células T (CD3/PE, clone SK7), células B (CD19/BB515, HIB19), e de células B subconjuntos (CD23/APC, clone EBV-CS5, e CD27/PE, clone L 128). A solução de viabilidade celular 7AAD (VIA sonda) foi comprada para determinar a viabilidade celular. Todos os anticorpos foram comprados a Becton Dickinson. Brevemente, criopreservados PBMCs foram descongeladas e suspensão em 50 μl de BSA mancha de buffer (Becton Dickinson) e incubadas à temperatura ambiente, no escuro, com pré-diluído fluorocromo-conjugados de anticorpos por 30 minutos. As CMSP foram então lavadas duas vezes com tampão de mancha BSA e ressuspendidas em 500µL de tampão BSA para análise da citometria de fluxo. As suspensões de controle PBMC foram preparadas com o mesmo procedimento. 20 000 células viáveis determinadas pelo corante de viabilidade celular foram acondicionadas e recolhidas para análise de três cores em conjuntos de CD3/CD19/CD23 e CD19/CD27/CD23. Os dados foram analisados utilizando o CellQuest Pro software (Becton Dickinson).

2.5. Ensaio de proliferação LCLs

para separar o LCLs em duas categorias (crescimento rápido e lento), a taxa de proliferação celular foi determinada utilizando o ensaio de viabilidade celular em tempo real Glo MT (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. Trata-se de um ensaio não-óptico baseado na luminescência que pode detectar a proliferação em tempo real de células vivas em cultura até 72 horas. Brevemente, 10 000 células / poço foram semeadas numa placa branca plana de 96 poços (Greiner Bio-one) em triplicado. A mistura de reação 2X foi preparada a partir do kit fornecido e adicionada a cada poço. As células foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 hora antes da medição ter sido feita em diferentes pontos temporais.(0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, e 72 horas) utilizando um leitor de microplacas de luminescência (Tecan). As unidades de luminescência relativa (RLUs) versus grafo de tempo foram desenhadas para mostrar a curva de crescimento do LCLs. Neste gráfico, o número de células foi representado pelo RLUs. Usando o RLUs, o tempo de duplicação (tempo necessário para que um número de célula duplique em valor) de cada categoria de LCLs foi calculado usando uma calculadora online multiponto que foram usados para testes de significância . Esta ferramenta online usa o método de ajuste exponencial dos mínimos quadrados para calcular o tempo de duplicação . A taxa de crescimento (número de duplicações que ocorrem por unidade de tempo) foi então calculada usando a fórmula abaixo:o valor médio de todo o tempo de duplicação do LCLs foi de 54,69 horas. Portanto, este valor foi usado como o corte e LCLs com tempo de duplicação superior a 54.69 horas foram agrupadas em LCLs de crescimento lento e vice-versa para LCLs de crescimento rápido.

2.6. A análise estatística

a análise da citometria de fluxo foi realizada em três experiências independentes para cada categoria de LCLs, salvo especificação em contrário. Os dados foram expressos em valores médios desvios-padrão (DST. desenvolvimento). A significância foi determinada utilizando testes não paramétricos (Mann-Whitney e Kruskal-Wallis H) nos quais os dados são considerados significativos quando p é inferior a 0,05.

3. Resultados e discussão

3.1. A actividade da doença nos indivíduos do estudo

a Tabela 1 mostra os dados demográficos dos dezasseis doentes com ar e de um indivíduo saudável, bem como os resultados das suas análises ao sangue de marcadores diagnósticos de ar habitualmente utilizados, indicando as suas actividades da doença. Com base no índice DAS28-CRP de 16 doentes com ar, 3 destes doentes foram classificados como actividade elevada da doença, 8 como actividade moderada, 3 como remissão, e os restantes dois como estado desconhecido devido à recolha incompleta de dados.

3.2. A geração de LCLs

PBMCs foi colhida dos dezasseis doentes com ar e de um dador saudável (rotulado como C) (Quadro 1) e criopreservado. Alíquotas de PBMC criopreservados foram então usados para a infecção por EBV. Dos dezessete frascos, 15 LCLs transformados em EBV (exceto 4E e 14A) foram gerados uma semana após a infecção, em que aglomerados celulares visíveis foram vistos a partir dos frascos. Quando visualizado ao microscópio, o LCLs mostrou morfologia típica de roseta com vários tamanhos, conforme indicado pelas setas vermelhas (Figura 1). A taxa de sucesso da geração LCLs foi de 88,23% (15 em 17).

Figura 1

exame microscópico de células B imortalizadas derivadas do EBV de um doente com ar 8A uma semana após a infecção. Estas células imortalizadas são anotadas como LCL-8A. as setas vermelhas mostram as magnificações do EBV como roseta-imortalizado LCLs em 4x (Painel superior), 10x (painel médio), e 20x (Painel inferior). As barras da escala estão indicadas em amarelo.

3.3. A taxa de crescimento e o cálculo do tempo de duplicação das LCLs geradas

determinámos então a taxa de crescimento de cada categoria gerada de LCLs utilizando um ensaio de proliferação celular sem luminescência e em tempo real. A figura 2 mostra a curva de crescimento de cada categoria de LCL representada pelas unidades de luminescência relativa (RLUs). A tabela 2 mostra o tempo de duplicação calculado e a taxa de crescimento dos respectivos LCLs usando uma calculadora online . A partir do tempo de duplicação obtido de cada categoria de LCLs, dividimos os LCLs em duas categorias usando 54.69 horas (valor médio de todas as LCL) Como valor-limite, o que resultou em 10 LCLs de crescimento rápido e 5 LCLs de crescimento lento (Quadros 2 e 4) (p<0, 05).

Figura 2

as curvas de Crescimento de LCLs. As unidades de luminescência relativa representam os sinais de viabilidade das células em vários pontos temporais. As linhas cheias representam os LCLs de crescimento rápido, enquanto as linhas pontilhadas representam os LCLs de crescimento lento.

3.4. A expressão de marcadores de superfície de LCLs

PBMCs e LCLs correspondentes foram submetidos a análise de citometria de fluxo para determinar a sua expressão de marcadores de superfície, incluindo CD3, CD19, CD23 e CD27. CD3 e CD19 são marcadores de superfície para células-T e células-B, respectivamente. Utilizando como exemplos as células T CD3+ e as células B CD19+, a Figura 3 mostra como as células T CD3 + e as células B CD19 + foram perfiladas e tratadas por citometria de fluxo. O nível de expressão foi então apresentado em percentagem do número total de linfócitos analisados que eram 20 000 células. Nas células PBMCs dos dadores, 29,78-81,8% eram células T, enquanto 2,35-45,95% eram células B. Após a transformação do EBV, as populações de células T diminuíram para 0-0, 27%, enquanto as populações de células B aumentaram para 68, 59-89, 35%. Isto indica claramente o sucesso da imortalização de células-B pelo EBV, que assumiu a população de células-T. Células T CD3+ senescidas e seriam completamente lavadas a partir do LCLs.

Figura 3

células-T (CD3) e células-B (CD19) de perfil de superfície por citometria de fluxo. O painel superior mostra a análise de CPSP isoladas do doente 8A, enquanto o painel inferior mostra a análise do LCL correspondente (LCL-8A). R1: 7AAD – células vivas; R2: linfócitos gatados; R3: células T gatadas; R4: células CD19+ B gatadas.

CD23 é um marcador de ativação de células B, enquanto CD27 é um marcador para as células B de memória . Em doentes com ar, níveis elevados de células B com expressão de CD23 foram previamente notificados como estando positivamente correlacionados com a actividade da doença, podendo potencialmente servir como alvo terapêutico . Em contrapartida, verificou-se que as células B CD27+ se correlacionavam negativamente com a actividade da doença, tendo-se verificado que estavam comprometidas em doentes com ar . No estudo atual, não foi possível diferenciar o padrão de expressão de CD23 e CD27 em PBMCs e LCLs (Tabela 3). A figura 4 mostra a concentração de CD19+, CD23+ e CD27+ a partir das CMSP isoladas do doente 8A e da LCL-8A correspondente por citometria de fluxo. De todos os LCLs, enquanto 68.59-89.35% foram CD19+ como esperado, eles exibem expressão de CD23 (16.94-58.9%) e CD27 (15.74-80.89%). As células B Co-expressoras CD23 e CD27 foram de 5,72-41,53% (Tabela 3).

3.5. Correlation of Disease Activity, Surface Marker Expression Level, and LCL Proliferation

a statistical analysis was performed to test the correlation between the disease activity and surface marker expressions; however, none of them showed significance. Do mesmo modo, a actividade da doença não se correlacionou com a taxa de crescimento dos LCL correspondentes.A partir do tempo de duplicação de cada categoria de LCL, foram determinados e submetidos a análise estatística valores médios para LCLs de crescimento rápido e lento. O quadro 4 mostra uma diferença significativa (p<0.05) em termos de tempo de duplicação entre as duas categorias. Da mesma forma, foram determinados os valores médios dos níveis CD23, CD27 e CD23+CD27+ da respectiva categoria. Os LCLs de crescimento rápido têm maior expressão de CD23 (42,39%) em comparação com os LCLs de crescimento lento (35,28%). No entanto, isto não é estatisticamente significativo (Tabela 4). Inversamente, a expressão CD27 e a co-expressão CD23/CD27 foram menores nos LCLs de crescimento rápido (36,15 e 13,36%, respectivamente) em comparação com os LCLs de crescimento lento (51,57% e 19,49%, respectivamente). Quando uma análise estatística é realizada, apenas os LCLs de crescimento rápido mostram significativamente menor na expressão CD27, mas não CD23/CD27. Para validar estes resultados, são necessários outros estudos com maior dimensão da amostra.

a alta expressão do CD23 pode ser devido à infecção ou transformação do EBV. Há evidências que mostram que a imortalização de células B pode depender da expressão celular CD23. O estudo mostrou que as células B CD23-negativas podem ser infectadas pelo EBV, mas não podem ser imortalizadas a menos que complementem com fatores de crescimento específicos . Um outro estudo demonstrou que as células B infectadas pelo EBV podem desenvolver-se em duas subpopulações distintas: CD58+IL6-e CD58+IL6+ . A antiga subpopulação de células B proliferou ativamente, enquanto a última deixou de proliferar. A expressão do CD23 pode também ser induzida pela expressão do antigénio nuclear EBV 2 (EBNA-2) após a transformação EBV de células B, como descrito anteriormente numa linha celular de linfoma de Burkitt (BL). Em contraste, a expressão mais elevada de CD27 em LCLs de crescimento lento pode sugerir os seus efeitos inibitórios na proliferação de LCLs.

4. Conclusões

CD23 poderia desempenhar um papel estimulante na transformação EBV das células B e no crescimento do LCLs. Nossos estudos mostraram que os LCLs de rápido crescimento exibiam maior expressão CD23 e menor expressão CD27 e expressão CD23CD27. Estudos adicionais com um tamanho de amostra maior são necessários para investigar em profundidade sobre a implicação da expressão do marcador de superfície na manutenção do EBV e no crescimento celular.

disponibilidade de dados

os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão incluídos no artigo.

conflitos de interesses

os autores declaram que não existem conflitos de interesses relativamente à publicação deste artigo.

agradecimentos

gostaríamos de agradecer ao Dr. Alan Soo-Beng Khoo da unidade de Patologia Molecular, Institute for Medical Research (IMR), Malásia, pela sua generosidade em fornecer-nos o EBV derivado B95-8 marmoset para o nosso trabalho de imortalização. Hooi-Yeen Yap é o receptor do Mestrado da Universidade de Sunway por Pesquisa Acadêmica. Esta investigação foi financiada pela Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) e Sunway Medical Centre Research Funds (SRC)./002/2017/ FR e SRC/003/2017/FR).

materiais suplementares

a tabela mostra os casos estudados com data de diagnóstico, amostragem de sangue, criopreservação PBMCs, imortalização EBV, e duração de PBMCs criopreservados. (Matérias Suplementares)