acest lucru are ca rezultat modificări colorimetrice (absorbanță) și fluorescență. Resazurina este albastră și non-fluorescentă, în timp ce resorufina este roșie și foarte fluorescentă. Este un test sensibil dacă se lucrează cu celule mai mari de 5×103 la 100 unktoxl, relativ netoxic și cu condiția să fie efectuat cu atenție, aceleași replici pot fi urmărite pe mai multe puncte de timp. Dezavantajul acestui test este că nu este o tehnică directă de numărare a celulelor, cum ar fi heamocitometria, deoarece semnalul de fluorescență sau absorbanță poate fi afectat atât de modificările numărului de celule, cât și de metabolismul celular.
materiale & metode
- 96 microplăcile din polistiren negru (Greiner Bio-One)
- alamarBlue (MorphoSys UK)
- cititor microplăci BMG LABTECH
celule osteoblaste umane cu trecere timpurie (plita 406-05a), furnizate de colecția europeană de culturi celulare ECACC, au fost însămânțate pe substraturile a și B la o densitate de 104 per eșantion. Probele au fost plasate fiecare într-un puț dintr-o farfurie cu 24 de puțuri, acoperite cu 1 ml de mediu de cultură și incubate pentru un total de 17 zile. Mediul de cultură a fost mediul 5a al lui McCoy conținând 10% ser inactivat termic, 1% glutamină și vitamina C (30 hectolitri/mL).
pentru măsurarea proliferării celulare, substraturile însămânțate au fost incubate timp de 4 ore (timpi de incubație mai mari pot fi utilizați pentru o sensibilitate mai mare) cu mediu de cultură proaspăt suplimentat cu 10% vol.alamarBlue. Un total de 10 replici au fost utilizate pentru fiecare substrat.
în urma incubării, 100 unqql mediu din fiecare godeu a fost transferat pe o microplacă de polistiren negru cu 96 de godeuri și reprodus de 3 ori. Fluorescența (excitație 530 nm, emisie 590 nm) a fost măsurată pe un cititor de microplăci BMG LABTECH. (Notă: detectarea colorimetrică poate fi monitorizată prin măsurători de absorbție la 570 nm, în timp ce se utilizează 600 nm ca lungime de undă de referință. Cu toate acestea, acesta tinde să fie mai puțin sensibil, deoarece există o suprapunere considerabilă a formelor oxidate și reduse ale alamarBlue XV atunci când sunt măsurate prin absorbanță).
reducerea numărului de celule alamarBlue, exprimată ca unități de intensitate a emisiei de fluorescență, a fost măsurată în zile 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 și 17 din perioada de cultură pentru diferite probe. Reducerea % a alamarBlue XV pentru fiecare caz a fost calculată folosind formula