TEXT
arsenik är en klass i human carcinogen som utgör en hälsorisk för människor. Arsenexponering är kopplad till hudcancer, blåscancer, diabetes, hjärt-kärlsjukdom och perifer kärlsjukdom (1, 2). U. S. Environmental Protection Agency (EPA) rankar arsenik först på sin Superfund-lista över farliga ämnen (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arsenik släpps ut i miljön genom geotermisk aktivitet, genom upplösning av mineraler och genom antropogena aktiviteter såsom industriella avloppsvatten, förbränning av fossila bränslen och användning av arsenikinnehållande bekämpningsmedel, herbicider, träskyddsmedel och fodertillsatser (3). Som ett resultat av användningen av arsenikförorenat bevattningsvatten ackumuleras arsenik i ris, kosthäftaren för hälften av världens befolkning (4). Arsenmetylering är en avgiftningsväg (5, 6). Många organismer har gener som kodar arsenit S-adenosylmetionin (SAM) metyltransferaser (benämnd ArsM i mikrober och AS3MT i högre organismer) som biotransformerar som (III) till metylerade arter, med Flyktig icke-toxisk trimetylarsin (7) som slutprodukt (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida är en gramnegativ bakterie som finns i vatten och jord, särskilt i rhizosfären med en relativt hög befolkningstäthet (10). Denna mikroorganism har studerats i stor utsträckning som en modell för biologisk nedbrytning av aromatiska föreningar såsom naftalen (11) och styren (12, 13). Konventionella saneringsmetoder, såsom jordgrävning följt av koagulationsfiltrering eller jonbyte, är dyra, störande och används inte i stor utsträckning (14). Sphingomonas desiccabilis och Bacillus Idriensis som uttrycker arsM kan ta bort arsenik från förorenad jord, men uttryck från en plasmid begränsar deras användbarhet (15). Pseudomonas arter har utsikter till rhizoremediering av organiska föreningar (16) men har inte använts för arsenikavlägsnande.
syftet med denna studie var att konstruera en stam av P. putida KT2440 med potential för avlägsnande av arsenik från förorenad jord. Vi använde Chlamydomonas reinhardtii arsM-genen som kodar för en ArsM-ortolog (CrArsM). In vitro, renad CrArsM metylerad som (III) till en mängd olika arter (se Fig. S1A i tilläggsmaterialet). Efter 7 h framställdes metylarsenit och dimetylarsenat i relativt lika stora mängder. Efter 14 timmar var produkten främst DMA (V), med mindre mängder trimetylarsinoxid och ingen MAs(III). Dessa resultat överensstämmer med sekventiella metyleringssteg till mono-, di-och trimetylprodukterna. Tmas (III) Gas kunde detekteras på H2O2-impregnerade filter genom oxidation till TMAs (V)o (se Fig. S1B i tilläggsmaterialet). Dessa resultat visar att renad CrArsM katalyserar tre sekventiella omgångar av AS (III) metylering och omvandlar giftigt oorganiskt arsenik till mindre giftiga eller icke-toxiska organiska arsenik.
C. reinhardtii arsM-genen bakom kanamycinpromotorn integrerades i kromosomen av P. putida KT2440, som inte har en arsM-gen och inte metylerar arsenik. Minitransposon leverans plasmid pBAM1 användes som en självmordsvektor för att generera stabila integrationer som kunde uttrycka arsM konstitutivt. ArsM-genen klonades i pBAM1 (se Fig. S2 i det kompletterande materialet) och överfördes därefter från Escherichia coli cc118 Exceplipir till P. putida KT2440 genom trepartskonjugering med hjälpstam. Vildtyp P. putida har två kromosomala arsRBCH-operoner och kan växa i närvaro av 2 mM As(III), vilket ger en konkurrensfördel för P. putida i förorenad jord (10). Detta kan vara en avgörande faktor för att upprätthålla tillväxten av celler i närvaro av inhemska bakteriepopulationer (14). Celler av P. putida KT2440 som uttrycker CrArsM var resistenta mot 7,5 till 10 mM Som(III) i flytande basalt salt M9 medium (Fig. 1). Biotransformering av arsenik av cellerna analyserades med 25 kg som (III) eller arsenat (Fig. 2). Efter 12 h, konstruerad P. putida biometylerad som (III) främst till DMA(V) och, i mindre grad, metylarsenat (Fig. 2A). På ett tidsberoende sätt producerade de konstruerade cellerna dimetylarsin och tmas(III) gaser, identifierade genom att oxidera dem till DMAs(V) och TMAs (V)O med H2O2 (Fig. 2B). Dessutom kvantifierades produkten av metyleringsreaktionen i celler av P. putida som uttrycker CrArsM. Efter 48 timmar var den huvudsakliga produkten som hittades i odlingsmediet DMA(V) (57% av total arsenik), med mindre mängder MAs(V) (31%) och ännu mindre TMA(V)O (8%) (Fig. 2C). Den transgena P. putida-stammen metylerades snabbt som (V) (Fig. 2A, kurva 4). Det finns två arsRCBH operoner i kromosomen av P. putida, så det är rimligt att anta det kromosomalt kodade ArsC-reduktaset snabbt reducerat som(V) Till As(III), substratet av CrArsM, vilket gör att jordbakterien kan metyla både som(V) och som(III).