fetma och associerade comorbiditeter, till exempel diabetes, hypertoni och hjärt-kärlsjukdomar, representerar de vanligaste hälsoriskerna över hela världen och förekomsten har mer än fördubblats under de senaste 35 åren och uppstod redan i barndomen. Biologiskt, för att fettmassan ska ackumuleras förutom proliferation, är differentiering av fibroblastliknande prekursorceller (preadipocyter) i lipidfyllda mogna adipocyter en viktig process för vävnadsutvidgning. Därför är förståelsen av de molekylära händelserna i denna process av adipocytutveckling, differentiering och biologi av växande betydelse.
Preadipocytcellinjer, såsom murina 3T3‐L1, eller primära adipocyter från möss, råttor eller människor fungerar som experimentella modeller för human adipogenes och används ofta för att karakterisera adipogena regulatorer och därigenom ge betydande insikter i molekylära processer som reglerar adipogenes. Ändå finns det vissa begränsningar för generaliserbarheten för fysiologin för human adipogenes, som till exempel 3T3‐L1-celler är spontant odödliga aneuploida embryonala fibroblaster och de härrör från mus. Å andra sidan kan primära humana preadipocyter inte expanderas till höga cellantal utan att förlora sin förmåga att differentiera till mogna adipocyter. Dessutom finns det en hög grad av interindividuell variabilitet för övergående kulturer från celler av individer, vilket begränsar generaliserbarheten.
år 2001 etablerades en human preadipocytcellinje härledd från en pojke med Simpson–Golabi–Behmel-syndromet (SGBS), vilket visade sig vara ett lämpligt modellsystem för in vitro-studier i adipocytforskning. SGBS preadipocyter är av mänskligt ursprung, diploida, differentierar i ett serumfritt, kemiskt standardiserat medium och möjliggör reproducerbara experiment eftersom cellantalet i stor utsträckning kan ökas medan cellerna behåller sin goda differentieringskapacitet i mer än 30 generationer. SGBS-modellen har använts för många studier, såsom farmakologisk testning, genetiska influenser på adipocytbiologi och adipogenes eller karakterisering av adipokiner. Som principbevis har uttrycksprofilerna för gener som GLUT4, leptin eller lipoproteinlipas (LPL) i differentierande sgbs preadipocyter visat sig likna de för primära humana preadipocyter från fettvävnadsbiopsier. En kvalitativ jämförelse av proteiner utsöndrade från SGBS preadipocyter och differentierade sgbs adipocyter har emellertid ännu inte utförts.
här utförde vi en omfattande analys av protein-och expressionsprofilen för sgbs-celler under tiden för adipocytdifferentiering. För att karakterisera adipocytdifferentiering på proteom-och transkriptomnivå differentierades humana SGBS preadipocytesceller som beskrivits tidigare. I korthet differentierades subkonfluenta SGB-preadipocyter i DMEM / Ham: s F12 innehållande 33 ACC biotin, 17 ACC pantotenat, 10 ACC mL apo‐transferrin, 20 nm insulin, 10 nm hydrokortison och 0,2 nm triiodotyroxin i 10 dagar. Under de första 4 dagarna av differentiering kompletterades mediet dessutom med 25 nm dexametason, 500 kg isobutylmetylxantin och 2 kg rosiglitazon (för detaljerad information se stödjande Information).
för proteomanalysen använde vi stabil isotopmärkning i cellkultur (SILAC) i kombination med LC‐MS/MS för en exakt djupgående kvantitativ proteomanalys av intracellulära och utsöndrade proteiner som beskrivits tidigare. Alla experiment utfördes i biologiska triplikat.
vi identifierade 3737 intracellulära proteiner av vilka 2602 på ett tillförlitligt sätt kvantifierades i minst två av de tre biologiska replikaten. I sekretomanalys identifierades 390 proteiner varav 39 proteiner inkluderade etablerade adipogena regulatorer och modulatorer såsom apolipoprotein E (APOE) och adiponectin (ADIPOQ) kvantifierades. Sammantaget uttrycktes nästan hälften av de intracellulära och extracellulära proteinerna differentiellt under adipocytdifferentiering (Figur 1a).
analysen av den subcellulära lokaliseringen av proteiner enligt Go (Gen ontologi) databasanmärkning visade anrikning av cytoplasmatiska proteiner, men också av kärn-och mitokondriella proteiner (Figur 1b). 1135 intracellulära proteiner och 18 utsöndrade proteiner bestämdes att regleras signifikant med en log2-faldig förändring av > 0.5 och ett p-värde på < 0,01 (två tailed t‐test med ojämn varians) (figur 1C, tabell S1, stödjande Information).
alla reglerade proteiner grupperades enligt de kommenterade Go-biologiska processerna och kanoniska vägarna samt till deras tilldelning till metaboliska vägar som tillhandahålls av Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). Majoriteten av de reglerade proteinerna är involverade i metaboliska vägar, till exempel trikarboxylcykel och mitokondriell respiratorisk kedja, såväl som fettsyra‐beta-oxidation (figur 2a). Analys av molekylära proteinfunktioner visade en anrikning av poly (a) RNA‐bindande proteiner, cadherinbaserade cell‐cellinteraktionsproteiner, oxidoreduktaser, ribosomala proteiner och aktinbindande proteiner (Figur 2B). KEGG-väganalys av de differentiellt uttryckta proteinerna avslöjade att aminosyrametabolism, cellandning och fettsyrametabolism var bland de mest signifikant reglerade (figur 2C). Flera proteiner involverade i peroxisomproliferatoraktiverad receptorisk (PPARy) signalväg uppreglerades, som beskrivits tidigare. Sammantaget åtföljs differentiering av adipocyter av en stor grad av differentiellt proteinuttryck med lipid-och aminosyrametabolismrelaterade vägar som är de mest drabbade.
för en omfattande analys av proteomet i förhållande till transkriptomen analyserade vi vidare genuttrycksprofilen under adipogenes med en Affymetrix GeneChip Expressionsanalys. För detta bearbetades 5 USC totalt RNA för mikroarrayanalys. Omvänd transkription, in vitro transkription, fragmentering och hybridisering av proverna utfördes enligt tillverkarens rekommendationer. Prover hybridiserades till HG U133A 2.0 arrays. Skanning och första databehandling utfördes med GeneChip-operativsystem. Sample cell intensitet (CEL) filer importerades till GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) med hjälp av RMA-algoritmen för rå databehandling. Varje gen på varje grupp normaliserades till medianen av alla mätningar av den genen. En gen ansågs allmänt som inte uttryckt när den råa uttryckssignalen var under 100 i alla prover. Lugnande, i huvudkomponentanalys, grupperas prover i distinkta differentieringsstadier (figur S1, stödjande Information). För statistisk analys grupperades prover i preadipocyter (n = 3), tidig differentiering (n = 3), mellanliggande fenotyp (n = 2) och mogna adipocyter (n = 3) enligt uttrycksprofiler (stödjande Information). Varianserna som uppskattades av Korsgenfelmodellen användes vidare för statistisk testning. Data deponerades i Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) och GEO datamängder GSE123385.
totalt 14372 av 22277 testade transkript uttrycktes i SGBS-celler vid vilken tidpunkt som helst av differentiering, kodning för 9346 unika proteiner. 1520 av dessa kvantifierades också på proteinnivå (tabell S2, stödjande Information). 313 gener (3,3%) representerade av 404 (2,8%) transkript hade uttrycksförändringar >femfaldigt under adipocytdifferentiering (tabell S3, stödjande Information). Korrelationsanalyser avslöjade att reglering på proteinnivån starkt motsvarade transkriptomnivån som jämför adipocyter med preadipocyterna (figur S2, stödjande Information).
därefter analyserade vi typiskt adipocytmarköruttryck under adipogenes vid transkriptom-och proteomnivån för att testa robustheten hos den molekylära signaturen för differentiering. Vi hittade en uppreglering av proteiner som är involverade i adiponektinuttryck, kolesterolsyntes (acetyl‐CoA acetyltransferas, lipas e), aminosyrametabolism (aminoacylas) och faktorer som är involverade i lipogenes och lipolys (acetyl‐CoA-karboxylas Macau och acaca (ACACB)). Dessutom typiska markörer för mogna adipocyter som LPL, fettsyrabindande protein 4 (FABP4), fettsyrasyntas (FASN), stearoyl‐CoA-desaturas och APOE uppreglerades. Däremot observerades latexin (LXN), en hämmare av karboxipeptidas A1, 2 och 4 att nedregleras. Vi identifierade de tre preadipocytmarkörerna, LXN, transkriptionsfaktor GATA – 6 (GATA6) och C‐X‐C-motivkemokin 6 (CXCL6) och de fyra mogna adipocytmarkörerna LPL, ACACB, APOE och ATP citratlyas (ACLY) (figur S3, stödjande Information).
för att validera markörgenuttrycksprofilerna och för att identifiera de med den högsta adipocytstatusförutsägelseförmågan utförde vi TaqMan RT‐PCR i tre oberoende sgbs-differentieringsexperiment (stödjande Information). I sgbs-celler kunde vi validera genuttrycksprofilerna för alla sju markörgener och visade en signifikant reglering under sgbs-differentiering. Fem markörgener validerade med qPCR i sgbs-celler reglerades också i samma riktning på proteomnivå (Figur 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ och APOE uppreglerades signifikant i mogna adipocyter, medan LXN var signifikant nedreglerad.
sammantaget uppvisar SGB-adipocyter nyckelfunktioner och nyckelprotein och mRNA-signaturer av primära däggdjursadipocyter, till exempel morfologiska egenskaper såväl som molekylära kännetecken som aktiveringen av PPARy-vägen. Här visar vi att även uttrycket av flera typiska adipokiner (t.ex. ADIPOQ) och mogna adipocytmarkörer (t. ex. LPL, FABP4, FASN) induceras i sgbs-celldifferentiering. Dessutom avslöjar de erhållna data en metabolisk programmering under adipogenes, med lipidmetabolismrelaterade vägar som är mest drabbade.
vi förväntar oss att proteomik-och transkriptomikdata som presenteras här är av intresse för vidare tillämpning och etablering av SGBS‐celler som ett väl karakteriserat modellsystem för adipocytdifferentiering samt för identifiering av markörgener, som kan användas för att karakterisera humana fettvävnadsbiopsier i termer av komposition och differentieringstillstånd. Våra data kan underlätta och vägleda framtida studier med fokus på reglering av adipogenes och mänskliga adipocytsignaturer.