Ciò si traduce in cambiamenti colorimetrici (assorbanza) e fluorescenza. La resazurina è blu e non fluorescente mentre la resorufina è rossa e altamente fluorescente. È un saggio sensibile se si lavora con celle superiori a 5×103 per 100 µL, relativamente non tossico e a condizione che venga eseguito con attenzione, le stesse repliche possono essere seguite su più punti temporali. Lo svantaggio di questo test è che non è una tecnica di conteggio cellulare diretta come l’heamocytometry, perché il segnale di fluorescenza o assorbanza può essere influenzato da entrambi i cambiamenti nel numero di cellule e nel metabolismo cellulare.
Materiali & Metodi di
- 96 ben polistirene nero piastre microtiter (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH lettore di micropiastre
Primi passaggio Umano degli Osteoblasti cellule (piano Cottura 406-05a) fornito dalla Collezione Europea di Colture di Cellule ECACC sono stati seminati su substrati A e B, con una densità di 104 per esempio. I campioni sono stati posti ciascuno in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti, coperti con 1 ml di terreno di coltura e incubati per un totale di 17 giorni. Il mezzo di coltura era il mezzo 5A di McCoy contenente il 10% di siero inattivato dal calore, l ‘ 1% di glutammina e vitamina C (30 µg/mL).
Per misurare la proliferazione cellulare, i substrati seminati sono stati incubati per 4 ore (tempi di incubazione più lunghi possono essere utilizzati per una maggiore sensibilità) con terreno di coltura fresco integrato con 10 vol% alamarBlue®. Un totale di 10 repliche sono state utilizzate per ogni substrato.
Dopo l’incubazione, un mezzo di 100 µL da ciascun pozzetto è stato trasferito su una micropiastra di polistirene nero da 96 pozzetti e replicato 3 volte. La fluorescenza (eccitazione 530 nm, emissione 590 nm) è stata misurata su un lettore di micropiastre BMG LABTECH. (Nota: il rilevamento colorimetrico può essere monitorato mediante misure di assorbanza a 570 nm, utilizzando 600 nm come lunghezza d’onda di riferimento. Tuttavia, tende ad essere meno sensibile perché c’è una notevole sovrapposizione delle forme ossidate e ridotte di alamarBlue® quando misurate dall’assorbanza).
La riduzione di alamarBlue® da parte delle cellule espressa come unità di intensità di emissione di fluorescenza è stata misurata in giorni 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 e 17 del periodo di coltura per diversi campioni. La riduzione % di alamarBlue® per ciascun caso è stata calcolata utilizzando la formula