Frontiere Cellular Neuroscience

Introduzione

La neurotrofina fattore di crescita nervosa (NGF) è coinvolto in diversi processi critici in via di sviluppo e maturi sistema nervoso dei mammiferi, tra cui innervazione di destinazione, la differenziazione cellulare e la sopravvivenza neuronale (Grossi et al., 1986; Li et al., 1995; Sofroniew et al., 2001; Lad et al., 2003). Nel cervello adulto, l’NGF svolge un ruolo chiave nel mantenimento e nella funzione del sistema colinergico basale del proencefalo (Lad et al., 2003). I livelli di NGF sono più alti nelle aree che ricevono il maggior numero di proiezioni colinergiche basali del proencefalo, vale a dire l’ippocampo e la corteccia (Korsching et al., 1985; Shelton e Reichardt, 1986) e i recettori per l’NGF nella corteccia sono in gran parte confinati alle proiezioni corticopetali basali del proencefalo (Kordower et al., 1988; Sofroniew et al., 2001; Rossi et al., 2002). La segnalazione del fattore di crescita del nervo mantiene le proiezioni corticopetali colinergiche durante l’età adulta (Chen et al., 1997; Debeir et al., 1999) e può prevenire la degenerazione di questi neuroni dopo la transezione dei loro assoni (Hefti, 1986; Tuszynski et al., 1990; Kordower et al., 1994). Inoltre, NGF migliora il rilascio di acetilcolina dalle colture basali del proencefalo (Auld et al., 2001) e può modulare la funzione colinergica attraverso il controllo fenotipico del locus del gene colinergico (Rylett et al., 1993; Hu et al., 1997).

Il sistema colinergico del proencefalo basale influenza l’apprendimento e la plasticità dipendente dall’esperienza nella corteccia (Bakin e Weinberger, 1996; Kilgard e Merzenich, 1998; Conner et al., 2003, 2005), e la segnalazione NGF è stata ipotizzata per supportare, e possibilmente migliorare, l’apprendimento e la plasticità mediate dal proencefalo basale. Ad esempio, il blocco della segnalazione di NGF tramite iniezioni ripetute di anticorpi NGF nella corteccia insulare riduce l’innervazione colinergica locale e interrompe l’acquisizione di due processi che dipendono dall’integrità degli input colinergici, dall’avversione al gusto condizionata e dall’apprendimento dell’evitamento inibitorio (Gutierrez et al., 1997). Un recente studio di Conner et al. (2009) ha dimostrato che sia l’apprendimento spaziale che il potenziamento a lungo termine dell’ippocampo (LTP) sono migliorati in seguito alle infusioni di NGF nel nucleo del setto, la fonte primaria di innervazione colinergica all’ippocampo.

L’applicazione focale di NGF può anche indurre una rapida espansione della rappresentazione locale del baffo nella corteccia del barile dei ratti. Questo processo dipende dalle proiezioni colinergiche dal proencefalo basale (Prakash et al., 1996, 2004), suggerendo che la segnalazione corticale di NGF può stimolare la riorganizzazione funzionale colinergica-dipendente rapida. Pertanto, oltre ai suoi effetti trofici a lungo termine sulle cellule colinergiche basali del proencefalo, l’NGF può anche partecipare al rimodellamento del circuito a breve termine. Questa ipotesi di “doppia azione” è supportata dall’esistenza di meccanismi di rilascio costitutivi e dipendenti dall’attività di NGF (Blochl e Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), potenzialmente alla base degli effetti trofici a lungo termine e modulatori a breve termine di NGF, rispettivamente. Inoltre, sia le vie di segnalazione retrograde (a lungo termine) che locali (a breve termine) sono state osservate per NGF (Huang e Reichardt, 2003).

Le cellule che esprimono NGF sono state rilevate nella corteccia, nel cervelletto, nell’ippocampo, nel talamo, nello striato, nel proencefalo basale e nel tronco cerebrale (Gall e Isackson, 1989; Maisonpierre et al., 1990; Isackson et al., 1991; Conner e Varon, 1992; Hayashi et al., 1993; Mufson et al., 1994; Zhang et al., 2007). Sebbene l’mRNA di NGF sia stato osservato negli astrociti e in altri glia, la stragrande maggioranza dell’NGF corticale è prodotta dai neuroni (Sofroniew et al., 2001). I tipi specifici di neuroni che producono NGF nella corteccia non sono noti, tuttavia, e le proiezioni corticopetali colinergiche hanno dimostrato di innervare entrambi i neuroni eccitatori e inibitori nella corteccia (Zaborszky et al., 1999). Nelle regioni extracorticali come l’ippocampo, lo striato e il proencefalo basale, la produzione di NGF è prevalentemente localizzata nei neuroni inibitori gabaergici (Lauterborn et al., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon et al., 1999). L’identificazione delle cellule produttrici di NGF nella corteccia è importante per identificare i potenziali meccanismi alla base della modulazione degli input corticali colinergici e dei meccanismi della plasticità corticale. Nell’attuale studio, identifichiamo un sottoinsieme di cellule gabaergiche corticali come fonte primaria di produzione di NGF nella corteccia adulta, con produzione relativamente rara da parte dei neuroni glutammatergici.

Materiali e metodi

Tutti i soggetti sono stati trattati in conformità alle linee guida istituzionali per la cura degli animali. A causa di bassi livelli endogeni di espressione corticale di NGF che vietavano l’identificazione di specifiche fonti di tipo cellulare di NGF in studi precedenti, abbiamo eseguito infusioni di colchicina locale per inibire la polimerizzazione dei microtubuli, bloccando così il trasporto di NGF dal corpo cellulare e con conseguente accumulo di antigene NGF rilevabile nel soma delle cellule produttrici (Schubert et al., 1972; Hokfelt et al., 1975; Hanson e Edström, 1978; Conner e Varon, 1992). Rapporti precedenti hanno dimostrato che il trattamento con colchicina aumenta la rilevazione di NGF utilizzando tecniche immunoistochimiche (Conner e Varon, 1992). Inoltre, i livelli di colchicina simili a quelli utilizzati nello studio attuale non inducono anomalie grossolane nella distribuzione neuronale del membro della famiglia delle neurotrofine BDNF (Conner et al., 1997).

Preparazione del tessuto

Otto ratti adulti Fischer 344 (4 maschi, 4 femmine; Harlan Sprague Dawley) sono stati anestetizzati con 2 ml/kg di ketamina da 25 mg/ml, xilazina da 1,3 mg/ml e cocktail di acepromazina da 0,25 mg/ml e iniettati con 5.0 µl di colchicina (10 µg/µl in aCSF) nelle posizioni corticali elencate di seguito ad una velocità di 0,5 µl/min utilizzando una siringa Hamilton da 10 µl. Dopo l’infusione, l’ago è rimasto in posizione per quattro minuti per consentire un’adeguata diffusione al tessuto circostante. Quattro animali hanno ricevuto iniezioni bilaterali nella corteccia motoria primaria (M1) a +1,2 mm anteriore (A/P) e ±2,5 mm laterale (M/L) a bregma. Metà della soluzione è stata iniettata a 1,6 mm sotto la superficie del cervello (D/V) e il resto a 1,0 mm. I restanti quattro animali hanno ricevuto iniezioni unilaterali nella corteccia prefrontale (A/P: +3.0, M/L: +0,5, D/V: -2,3 e -1,8), corteccia temporale (A/P: -6,5, M/L: +5,0, D/V: -7,5 e -7,0) e corteccia parietale (A/P: -3,0, M/L: +5,0, D/V: -1,8 e -1,3). Dopo 48 h, gli animali sono stati profondamente anestetizzati e perfusi transcardicamente con 250 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (pH 7,4), seguita da 250 ml di paraformaldeide fredda 2% + 0,2% parabenzochinone in tampone fosfato 0,1 M. I cervelli sono stati estratti, postfissati per 2 ore nello stesso fissativo e crioprotetti in tampone fosfato da 0,1 M contenente saccarosio al 30% per almeno 72 ore a 4°C. Le sezioni coronali (40 µm) sono state tagliate su un microtomo scorrevole congelato e conservate in crioprotettore (TCS) a 4°C fino a quando non sono state ulteriormente elaborate per l’immunoistochimica.

Immunoistochimica a fluorescenza a doppia etichetta

L’immunoistochimica sequenziale a doppia etichetta è stata utilizzata per visualizzare i neuroni che esprimono NGF e marcatori cellulari gabaergici o glutamatergici. Le sezioni flottanti sono state lavate in soluzione salina tamponata Tris (TBS), permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,25% e l’etichettatura non specifica è stata quindi bloccata con siero d’asino al 5%. Sezioni sono state incubate per 72 ore a 4°C in anticorpo anti-NGF di coniglio (Conner e Varon, 1992) diluito 1:1000 in TBS, 0,25% Triton X-100 e 5% siero d’asino. Dopo l’incubazione primaria dell’anticorpo, le sezioni sono state incubate in IgG coniugate con biotina anti-coniglio (1: 200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). L’amplificazione del segnale tiramide (TSA; PerkinElmer, Waltham, MA, USA) è stata applicata per amplificare il segnale NGF, dopo di che le sezioni sono state lavate in TBS e incubate in Alexa Fluor 488 o 594-streptavidina coniugata (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) diluita 1:200 per 3 h a 4°C. Dopo un lavaggio breve, le sezioni sono state incubate in mouse anti-glutammato decarbossilasi (GAD) 65 (GAD-6, AntibodyRegistry:AB_528264,1:2000; Studi di Sviluppo di Ibridoma Banca, Iowa City, IA, USA) e il mouse anti-GAD67 (AnitbodyRegistry: AB_2278725, 1:1500; Millipore, Temecula, CA, USA), o in mouse anti-parvalbumin (AntibodyRegistry: AB_2174013, 1:30000; Millipore, Temecula, CA, USA), mouse anti-calbindin-D-28K (AntibodyRegistry: AB_476894, 1:1500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), o il mouse anti-Ca2+/calmodulina-dipendente della proteina chinasi IIa (CaMKIIa, AntibodyRegistry: AB_2067919, 1:1500; Millipore) per 72 h a 4°C. Infine, le sezioni sono state lavate, incubate in Alexa Fluor 594 o 488-coniugato asino anti-mouse (Invitrogen) per 3 h a temperatura ambiente, lavato di nuovo, montato su vetrini, e coverslipped in Fluoromount-G (Southern Biotech, Birminghan, AL, USA). Al fine di massimizzare l’identificazione delle cellule gabaergiche, gli anticorpi GAD65 e GAD67 sono stati co-incubati. Un sottoinsieme di sezioni è stato ricoperto in ProLong Gold con DAPI (Invitrogen) per la visualizzazione dei nuclei cellulari.

Caratterizzazione anticorpale

L’anticorpo NGF utilizzato in questo studio è un policlonale purificato per affinità sollevato nel coniglio contro l’NGF purificato del topo (Conner e Varon, 1992). L’anticorpo riconosce il topo purificato e l’NGF umano ricombinante ma non reagisce in modo incrociato con BDNF ricombinante o NT-3 (Conner e Varon, 1996). Inoltre, il modello immunoreattivo dell’espressione di NGF nel cervello di ratto corrisponde strettamente a quello ottenuto dall’analisi in situ nel cervello di ratto (Conner e Varon, 1997).

L’anticorpo monoclonale GAD-65 (Developmental Studies Hybridoma Bank, Gad-6) è stato prodotto immunizzando topi con immunoaffinità della proteina GAD-purificata dal cervello di ratto. L’analisi Western blot degli omogenati cerebrali di ratto ha rivelato che l’anticorpo riconosce selettivamente GAD-65 ma non GAD-67 (Chang e Gottlieb, 1988). Ulteriori studi hanno dimostrato che l’anticorpo GAD – 6 riconosce un epitopo situato tra gli amminoacidi 475-571 del C-terminale di GAD-65 (Butler et al., 1993).

Il topo monoclonale GAD-67 (Millipore, MAB 5406, lotto: 25010139) è stato sollevato contro residui di aminoacidi 4-101 di GAD-67 umana, e riconosce una singola banda 67-kDa sull’analisi Western blot del cervello di ratto (informazioni tecniche del produttore). La preincubazione dell’anticorpo con una proteina di fusione GST-GAD-67 non ha prodotto alcun segnale immunopositivo nel cervello (It et al., 2007).

Il topo monoclonale anti-CaMKIIa (Millipore, MAB 8699, lotto: LV1366080) riconosce specificamente la subunità alfa di calcio/calmodulina-dipendente protein chinasi II. L’analisi Western blot dimostra che l’anticorpo identifica una singola banda di 50 kDa e riconosce sia forme fosforilate che non fosforilate (Erondu e Kennedy, 1985).

Monoclonale anti-calbindin-D-28k (Sigma–Aldrich, C9848, sacco: 088k4799) è derivato da topi BALB/c immunizzati con purificato rene bovino calbindin-D-28k. Immunoblotting ha mostrato l’anticorpo riconosce di 28 kDa band, e non a reagire con altre molecole, come calbindin-D-9K, calretinina, catena leggera della miosina, e parvalbumin (produttore informazioni tecniche). È stato dimostrato che il preassorbimento con una proteina kDa calbindina-D-27 purificata dai cervelli di pulcino e ratto elimina l’immunocontenente calbindina nel cervello (Pasteels et al., 1987).

Anti-parvalbumina (Millipore, MAB 1572, lotto: LV1378387) è stato raccolto da topi immunizzati contro parvalbumina purificata dal muscolo della rana. L’anticorpo monoclonale è diretto contro un epitopo al primo sito di legame Ca2+e l’analisi immunoblot dimostra che riconosce una proteina cerebrale di 12 kDa (informazioni tecniche del produttore).

Analisi confocale

Le immagini sono state catturate utilizzando un Olympus AX70 con software Magnafire (versione 2.0; Karl Storz Imaging, Goleta, CA, USA). Poiché l’etichettatura NGF è stata ridotta sostanzialmente di circa 2 mm anteriore / posteriore ai siti di iniezione della colchicina, presumibilmente a causa della mancanza di diffusione della colchicina e della conseguente assenza di accumulo somatico di NGF, sono state analizzate solo sezioni entro 1,5 mm da ciascun sito di iniezione della colchicina. Ogni 10a sezione (400 µm) è stata esaminata all’interno di una regione corticale. Le cellule sono state contate manualmente e almeno tre sezioni sono state analizzate in ciascuna regione corticale e combinazione di anticorpi per soggetto. Solo tre animali sono stati valutati nella regione temporale a causa dell’etichettatura NGF non rilevabile nel quarto. Le celle singole e doppie sono state quantificate utilizzando immagini a singolo e doppio canale. Diversi criteri sono stati utilizzati per identificare le cellule etichettate, tra cui la dimensione, la morfologia, il segnale rispetto allo sfondo e l’etichettatura DAPI coincidente durante la valutazione del tessuto macchiato da DAPI. In un sottoinsieme di sezioni, 5 µm z-stack sono stati raccolti utilizzando un Olympus Fluoview FV1000 per garantire la localizzazione neuronale dell’oggetto etichettato. A causa del nostro interesse per la proporzione, e non il numero assoluto, delle cellule con doppia etichetta, non sono stati utilizzati metodi stereologici.

La percentuale di cellule a doppia etichetta per gruppo di cellule immunoreattive (IR) è stata determinata per ciascun campo dell’immagine. L’errore medio ± standard è stato calcolato per ciascuna regione corticale esaminata. L’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per valutare le differenze tra le regioni corticali. L’HSD di Fisher è stato utilizzato per l’analisi post-hoc. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con SPSS 15.0 per Windows.

Controlli anticorpali

I controlli comprendevano omissione di anticorpi primari, omissione di anticorpi secondari e sostituzione di anticorpi primari con anticorpi non specifici (IgG di coniglio). Tutte le manipolazioni hanno avuto gli effetti attesi e hanno sostenuto l’affermazione che le cellule etichettate rappresentano la vera etichettatura dell’antigene con i loro anticorpi corrispondenti.

Risultati

Immunolabeling NGF

L’etichettatura NGF distinta era visibile entro un raggio di 1.5 mm dal sito di iniezione corticale della colchicina. All’interno di queste aree, l’etichettatura NGF era prevalentemente limitata alla cellula somata (Figura 1). Raramente, uno o più processi cellulari potrebbero anche essere distinti. Al di fuori di questo raggio di 1,5 mm, l’etichettatura NGF era praticamente non rilevabile nella corteccia. Poiché l’espressione corticale dei recettori NGF TrkA e p75 sono limitati alle fibre corticopetali colinergiche, è improbabile che l’etichettatura osservata di NGF rifletta l’NGF endocytosed, ma è invece indicativa delle cellule produttrici di NGF (Holtzman et al., 1995; Rossi et al., 2002; Stephens et al., 2005). Come riportato in precedenza (Ribak et al., 1978), il trattamento con colchicina ha intensificato l’etichettatura GAD nei corpi cellulari e nei processi neuronali. La colchicina non ha avuto effetti rilevabili sull’etichettatura di parvalbumina, calbindina o CaMKIIa.

Co-localizzazione NGF e gabaergica

Fattore di crescita del nervo co-localizzato estesamente con i marcatori cellulari gabaergici GAD65 e GAD67, indipendentemente dall’area corticale esaminata (Figura 1; Tabella 1). Nel complesso, 91 ± 0,9% delle cellule corticali marcate con NGF etichettate anche per GAD65 / 67. La percentuale di cellule marcate con NGF che co-esprimono GAD65 / 67 ha mostrato poca differenza tra le cortecce prefrontali (90,0 ± 1,5%), motorie (91,7 ± 1,5%), parietali (89,6 ± 3,5%) e temporali (93,4 ± 8,1%) (ANOVA unidirezionale; p = 0,78). Al contrario, NGF co-localizzato con solo 55 ± 2.3% di tutte le cellule marcate con GAD65/67. Per determinare se la produzione di NGF fosse limitata a un sottotipo specifico di neurone gabaergico, abbiamo co-etichettato il tessuto per NGF e parvalbumina o calbindina (Figura 2). Le cellule marcate con NGF sono state osservate per colocalizzare con entrambi i marcatori. Tuttavia, la colocalizzazione di NGF con parvalbumina (67,8 ± 3,6%) era superiore a 2× maggiore rispetto a calbindina (29,1 ± 3,9%). Inoltre, le cellule NGF-IR costituivano meno della metà di tutte le cellule immunoreattive di parvalbumina (47,7 ± 4,6%) e calbindina (25,7 ± 4,9%).

I neuroni che esprimono il fattore di crescita del nervo sono stati osservati in tutti gli strati corticali. Studi precedenti hanno riportato una distribuzione non uniforme dei neuroni marcati con NGF nelle lamine corticali (Pitts e Miller, 2000; Patz e Wahle, 2006). L’analisi quantitativa per strato non è stata eseguita nello studio attuale, tuttavia, poiché l’intensità di etichettatura NGF diminuiva con l’aumentare della distanza dal sito di iniezione della colchicina.

La co-localizzazione NGF e glutammatergica

L’etichettatura per CaMKIIa è stata osservata principalmente all’interno dei processi somati cellulari e prossimali (Figura 3). A differenza dell’ampia co-localizzazione osservata con i marcatori NGF e gabaergici, le cellule etichettate con NGF raramente sono co-localizzate con le cellule etichettate con CaMKIIa (Figura 3; Tabella 2). In totale, 4,9 ± 1,1% delle cellule immunoreattive NGF sono state co-marcate con anticorpi CaMKIIa. La co-localizzazione differiva significativamente dalla regione corticale (ANOVA unidirezionale; p = 0,03); Il post hoc di Fisher ha rivelato che la corteccia prefrontale aveva una percentuale maggiore di cellule NGF a doppia etichetta (7,6 ± 2,1%) rispetto alla corteccia motoria primaria (2,4 ± 1,0%; p = 0,02) e alla corteccia parietale (2,9% ± 1,5; p = 0,01).

Le cellule immunoreattive per CaMKIIa superavano notevolmente quelle etichettate dagli anticorpi NGF. La percentuale complessiva di cellule marcate con CaMKIIa che esprimevano simultaneamente il segnale NGF era del 2 ± 0,6%. Questa percentuale differiva significativamente per regione (ANOVA unidirezionale p = 0,003), con la corteccia prefrontale che mostra una percentuale maggiore di cellule NGF/CaMKIIa a doppia etichetta (3,7 ± 1,1%) rispetto alla corteccia motoria primaria (0,8% ± 0,3; p = 0,001), alla corteccia parietale (1,4% ± 0,6; p = 0,01) e alla corteccia temporale (1,5 ± 0,6%; p = 0,01).

Discussione

L’attuale studio dimostra che la stragrande maggioranza (> 90%) dei neuroni che producono NGF della corteccia sono gabaergici, mentre la metà di tutti i neuroni gabaergici colocalizzano con NGF. Al contrario, i marcatori dei neuroni eccitatori mostrano solo una rara co-localizzazione con NGF. Questi risultati sono stati coerenti in più regioni corticali analizzate in questo studio, indicando che l’NGF è prodotto principalmente da interneuroni inibitori nella neocorteccia del ratto.

Sebbene l’immunoreattività NGF raramente coincidesse con i marcatori cellulari eccitatori (CAMKIIa), una piccola percentuale (~5%) era positiva per CaMKIIa in tutte le regioni corticali esaminate. L’analisi confocale ha confermato che questa doppia etichettatura proveniva dallo stesso piano focale e non era dovuta al segnale discreto derivante da celle sovrapposte. Il significato funzionale dell’espressione di NGF in una piccola frazione di cellule eccitatorie non è noto, ma è possibile che questi neuroni produttori di NGF rappresentino una sottoclasse precedentemente non identificata di neuroni eccitatori nella neocorteccia.

I nostri risultati sono coerenti con i risultati di studi precedenti in altre regioni del cervello che dimostrano che NGF co-localizza quasi esclusivamente con cellule gabaergiche nello striato, nel proencefalo basale e nell’ippocampo (Lauterborn et al., 1993, 1995; Pascual et al., 1998; Bizon et al., 1999). Pertanto, la produzione di NGF da parte delle cellule gabaergiche può essere una proprietà generale di tutti gli obiettivi che ricevono innervazione colinergica del proencefalo basale (incluso il proencefalo basale stesso). Queste popolazioni neuronali colinergiche richiedono NGF per il mantenimento del loro fenotipo e proiezioni (Rylett et al., 1993; Chen et al., 1997; Hu et al., 1997; Debeir et al., 1999). Attraverso gli studi, gli interneuroni inibitori emergono ora come fonte primaria di trofismo NGF per i neuroni colinergici basali del proencefalo.

Sebbene i neuroni colinergici basali del proencefalo innervino sia le reti corticali eccitatorie che inibitorie (Zaborszky et al., 1999), la fonte del supporto trofico è prevalentemente dalla popolazione inibitoria, che è nota per svolgere un ruolo critico nella mediazione della plasticità nei circuiti corticali (Hensch e Stryker, 2004; Yazaki-Sugiyama et al., 2009; Donato et al., 2013). La segnalazione colinergica sembra contribuire all’attivazione differenziale di varie sottopopolazioni inibitorie, modulando così l’equilibrio eccitatorio-inibitorio (Xiang et al., 1998; Froemke et al., 2007). NGF può quindi servire come segnale di feedback tra le reti inibitorie altamente plastiche e gli ingressi colinergici che li attivano. Infatti, NGF aumenta la plasticità e l’apprendimento comportamentale attraverso meccanismi dipendenti dal colinergico (Prakash et al., 1996, 2004; Gutierrez et al., 1997; Conner et al., 2009). Rilascio dipendente dall’attività di NGF (Blochl e Thoenen, 1995; Lessmann et al., 2003), accoppiato con la capacità di NGF di aumentare l’attività colinergica (Rylett et al., 1993; Hu et al., 1997; Auld et al., 2001), suggerisce che NGF può promuovere la riorganizzazione dei circuiti attivi attraverso una maggiore funzione colinergica.

Studi futuri tenteranno di identificare quali sottoclassi di neuroni inibitori esprimono NGF e come questa espressione influenza precisamente i circuiti corticali. A tal fine, abbiamo preso misure preliminari per determinare se NGF co-localizzato con due marcatori comuni di neuroni inibitori, parvalbumina (associata principalmente alle cellule del cesto e del lampadario) e calbindina (associata a numerosi tipi di cellule inibitorie; McBain e Fisahn, 2001; Markram et al., 2004). I nostri risultati dimostrano che l’NGF è stato rilevato principalmente nelle cellule immunoreattive di parvalbumina, sebbene molte cellule etichettate con parvalbumina non abbiano co-espresso NGF. È importante sottolineare che le cellule NGF-IR anche colocalizzate con cellule marcate con calbindina, suggerendo che più di una sottoclasse di neurone inibitorio produce NGF.

In sintesi, all’interno della neocorteccia del ratto l’NGF è espresso principalmente dai neuroni inibitori, una proprietà che sembra essere conservata da aree cerebrali filogeneticamente più vecchie e che può generalizzare al cervello nel suo complesso. I nostri risultati suggeriscono che gli interneuroni inibitori corticali svolgono un ruolo vitale nel mantenimento dei neuroni di proiezione colinergica del proencefalo basale. Gli interneuroni gabaergici possono quindi promuovere la riorganizzazione corticale tramite segnalazione NGF regolata.

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Finanziato dal NIH (AG10435), l’Amministrazione dei veterani, l’Associazione Alzheimer e la Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation.

Materiale supplementare

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online all’indirizzo: http://www.frontiersin.org/journal/10.3389/fncel.2014.00220/abstract