시약 안정성 및 향상된 감도 제공

효소 활성과 같은 생리 학적 특성의 정량적 측정은 종종 밀리그램 단백질 당 활성 단위로 표현됩니다. 아미도 블랙(1),바이 레트(2),비신 코닌 산(3)및 쿠 마시에 블루(4,5)의 비색 분석법을 포함하여 단백질 함량을 측정하기 위해 수많은 분석법이 개발되었지만 로리 분석법(6)또는 그 변형(7,8)이 다른 분석법(9)보다 더 일반적으로 사용됩니다. 로리 분석실험은 간단하고,과민하고 정확하,양이 많은 단백질 결심을 위한 인용된(10)절차입니다.

폴린-시오칼테우 페놀(폴린)시약(11)과 반응하는 다양한 화합물은 로리 및 변형된 로리 단백질 분석에서 잠재적인 간섭의 원인이다. 다행히도,적절한 블랭크를 통한 보정은 지질(12),세제(13)및 착색 물질(14)을 제외한 대부분의 화합물(6,7)에 충분합니다. 지질 및 세제(지방 조직,미엘린 및 골격근의 가용화에 사용됨)의 존재 하에서 단백질 분석의 어려움은 수정 된 로리 분석(15;이 논문에서 유-1988 분석,16)에 의해 극복되었습니다. 레드 와인(14,17,18)의 단백질 함량을 결정하는 색상 간섭은 광범위한 크로마토 그래피를 사용하여 극복되었습니다. 위의 접근 방식은 번거롭고 많은 수의 샘플을 처리하는 데 매우 실용적이지 않습니다. 알려진 단백질 분석실험의 아무도는 착색한 생물학 견본에 있는 단백질 측정을 위해 적당하지 않았습니다 예를들면.,착색 한 청과,적포도주,착색 한 미생물 및 반추 동물 담즙.(1)시약 제제의 안정성,(2)감도를 손상시키지 않고 무색 및 유색 생물학적 시료 모두에서 단백질의 측정,(3)매우 낮은 농도의 단백질 분석. 이 새로운 분석실험은 지질(예를들면,아보카도)에서 부유한 그들 및 균질화하게 어려운 그들을 포함하여 무색기도 하고 착색한 생물학 표본 균질화물에 있는 단백질의 양이 많은 측정에 적용 가능할 것입니다.

재료 및 방법

생물학적 샘플–비트 뿌리,블루 베리 및 적포도주

비트 뿌리 및 블루 베리 균질화를 보충 재료에 기재된 바와 같이 제조 하였다. 레드 와인은 2012 년 분석 전에 단백질 추출이 필요하지 않았습니다.

화학 시약

차아염소산나트륨과 과염소산을 제외한 모든 화학 시약은 시그마 또는 시그마-알드리치(세인트루이스,미주리주)로부터 수득되었다. 미국). 차아 염소산 나트륨은 미국 뉴저지 주 아크 로스 유기물에서 유래했습니다. 1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지.산도 12.0 에서 탄산염에서 인산염 완충액으로 전환하여 시약 안정성이 향상되고 감도가 약간 증가하였다. 아세토니트릴은 세제 유도한 거품을 피하기 위하여 소개되었습니다. 나오는 단백질 분석실험에 있는 강수를 피하기 위하여 코를 대체했습니다. 또한,로리 시약의 다양한 구성 요소를 하나의 시약 믹스로 결합함으로써 효율이 향상되었습니다.

유-2012 년 분석실험

유-2012 년 분석실험의 상세사항은 보충 물자에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 그림 1 에 간략하게 요약되어 있으며,적포도주와 비트 뿌리와 블루베리의 균질화물의 가공에 대해 설명하고 있습니다. 이 분석법은 처리되지 않은 단백질,처리 된 단백질 및 역 처리 된 단백질에 대해 사용되었습니다. 표준 곡선의 개발 및 착색 된 생물학적 시료에서 이소 시트 레이트 탈수소 효소,리소자임 및 트립신에 대해 분석 하였다. 생물 학적 샘플에서 단백질의 결정 적절 한 표준 곡선을 보정 하 여 수행 되었다.

그림 1 에 설명된 바와 같이 폴린의 시약을 사용하거나 사용하지 않은 채,처리되지 않은 비트 뿌리,블루베리 및 적포도주 샘플의 흡수성을 비교함으로써 색 간섭을 측정하였다. 이 비율은 폴린의 시약으로 처리되지 않은 시료의 흡광도 인 간섭의 정도를 확립하는 데 사용되었으며,폴린의 시약으로 처리되지 않은 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도 인 폴린의 시약으로 처리 된 시료의 흡광도; 폴린의 시약없이 처리 된 샘플의 흡광도.

표준 곡선과 그 매개 변수

솔루션-1 비 및 1 씨 표준 곡선의 개발에 대 한 첨부 된 보조 자료의 조리법 섹션에서 설명 했다. 분산형 그래프를 사용하여 농도와 해당 흡광도 값을 플롯했습니다. 이 그래프의 형태(그림 2)는 매우 제한된 초기 선형 응답으로 더 높은 농도에서의 포화 반응을 보여줍니다. 이것은 이전에 보고된 바람직한 곡선 형태였다(20). 처음에 이것은 지수 형태(19)를 사용하여 모델링되었지만 이후 연구는 직사각형 쌍곡선이 특히 낮은 농도에서 응답과 향상된 정렬을 제공한다는 것을 보여주었습니다. 이 후자의 형태는 이제 표준화되었으며 다음과 같은 세 가지 매개 변수 방정식을 사용하여 흡광도-단백질 농도 관계를 설명했습니다:

따라서,단백질 농도는 최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,최대 농도에서의 흡광도,

마이크로소프트 엑셀의 툴박스 애드인 솔버 함수를 사용하여 추정하였다. 시험 매개 변수 집합 방정식을 사용 하 여 각 표준 농도(콩)에서 모델링 흡광도 계산 하는 데 사용 되었다. 그 후 솔버는 측정된 흡광도와 모델링된 흡광도 사이의 잔여 표준 편차를 최소화하도록 명령받았습니다.

우리는 흡광도와 농도 사이의 관계를 관찰하여 전체 농도 범위에 걸쳐 비선형 곡선을 나타 냈는데,이는 흡광도를 측정 할 때 단백질 농도가 증가함에 따라 증가하는 광 산란 성분으로 인한 것일 수 있습니다. 낮은 흡광도에서 빈약 한 선형 적합은 또한 코 클리와 제임스(20)에 의해보고되었다.

균질화물에서의 단백질 함량의 계산

비트 뿌리 및 블루 베리의 가공 및 처리되지 않은 적포도주 및 균질화물에 대한 분석을 수행 하였다. 단백질 샘플 및 기타 단백질 샘플을 적절한 표준 곡선에 대해 동일하게 처리하여 다음을 확인했습니다. 이 매개변수는 그 때 각 균질물에 있는 단백질 농도로 표본 흡수도(아)를 사용하여 개조하기 위하여 이용되었습니다:

방정식은 포화 형태를 가지고 있기 때문에,감도는 흡광도 감소(에이),따라서 농도,증가. 단백질 추정에 있는 과실은 분석실험에 있는 균질물의 농도를 조정해서 지나치게 씨 50 가치를 초과하지 않는다 그래야 극소화될지도 모릅니다.

다음 화학식을 사용하여 균질화 콩크 값을 조직 단백질 농도(조직의 밀리그램/그램에서 조직 콩크)로 전환시켰다:

분석 중 사전 농도 또는 희석에 대해 교정되었습니다. 균질화 비율은 100 그램의 조직을 200 밀리리터의 총 부피로 균질화시켰다(우리의 경우 50%).

별도의 연구에서,직사각형 쌍곡선 모델은 비선형 혼합 효과 패키지(21)를 사용하여 장착되었습니다. 실험실에서는 독립적으로 만들어진 각각의 솔루션을 무작위 효과로 모델링했습니다. 이것은 생물학적 샘플 복제 및 기술 분석 복제 계층 구조를 모델링합니다.1988 년 및 로리 분석실험의 한계는 탄산계 시약의 불안정성이다. 탄산염 완충액(산도 11.4 에서 2%=188.7 밀리미터)은 11.4 에서 12.5 까지의 산도 값에서 40 밀리미터 인산염으로 대체되었다. 단백질 분석실험의 표준 곡선으로부터의 초기 기울기는 0.5 밀리그램 비사소/밀리람베르트 및 1.0 밀리그램 비사소/밀리람베르트 에서 비사소/밀리람베르트 를 사용하여 계산되었다. 산도 11.4 및 최적의 산도 12.0 에서 인산염 완충액을 갖는 초기 경사면은 각각 99 엑스 10-6 및 197 엑스 10-6 이었다. 탄산염 완충액(산도 11.4)에 대한 기울기는 162 엑스 10-6 이었다.기울기 값은 분석 감도의 직접적인 표시이기 때문에 인산염 완충액(산도 12.0)는 감도에 있는 25%증가를 주는 탄산염 완충기를 대체하기 위하여 선택되었습니다.생성 된 인산염/쿠소 4/나-케이-타르트 레이트 용액은 단백질 분석 전에 매일 준비해야하는 탄산염/쿠소 4/나-케이-타르트 레이트 용액보다 상당히 긴 2 주 동안 실온에서 안정적이었다. 이 용액은 100 밀리의 포스페이트 용액과 12.0 밀리의 포스페이트 용액을 제조하는데 사용되었다. 우리는 인산염으로 탄산염의 보충이 유-2012 년 분석실험의 편익을 강화할 것이라고 믿습니다.

세제 유도 기포는 멀티 웰 플레이트 판독기를 사용할 때 흡광도 측정에서 주요 오류의 원인이됩니다(큐벳에서는 문제가 아님). 이들 기포는 다수의 극성 용매(예를 들어,아세톤,아세토니트릴,에탄올 및 메탄올)의 첨가에 의해 상당히 감소되었다. 이러한 용매 중 가장 극성 인 아세토니트릴(23)은 그 효과를 위해 선택되었으며 용액-2 에 포함되었습니다(그림 1 캡션 및 조리법 섹션 참조).

인산염 완충액,쿠소 4,나-케이-타르트 레이트,에스디 및 아세토니트릴을 개별적으로 첨가 할 수 있으며,그 첨가 순서는 결과 흡광도에 영향을 미치지 않는다. 그러나,미리 혼합한 해결책을 사용하여 특히 많은 견본이 분석될 때,편익을 더 강화하십시오. 따라서 분석 믹스의 이러한 구성 요소를 솔루션-2 로 그룹화했습니다(그림 1). 이러한 사전 혼합 용액은 탄산염 용액의 불안정성으로 인해 원래의 로리 분석(6)에 대해서는 실현 가능하지 않았다. 솔루션-3 을 솔루션-2 에 포함시키려는 시도는 파란색의 개발을 극적으로 감소 시켰으며 더 이상 고려되지 않았습니다.비트 뿌리 및 블루 베리의 단백질을 가벼운 균질화로 트리톤 엑스-100-나클 용액에서 추출 하였다. 이러한 균질화물은 효소 활성을 유지한다(15). 이 추출은 레드 와인에 필요하지 않았습니다.

간섭 물질 제거

유색 시료의 경우 비색 단백질 분석 전에 단백질 시약과 반응하는 고유 샘플 색상 및 기타 비 단백질 물질로 인한 간섭을 제거해야합니다. 유-2012 의 참신함은 비색계 단백질 분석과 호환되는 탈색 프로토콜을 고안하는 데 있습니다.

차아염소산나트륨 또는 물 2 에 의한 착색안료의 탈색 및 방해물질의 제거를 위한 단백질의 선택적 침전을 고려하였다. 아염소산나트륨,H2O2,TCA 및 PCA 평가를 위한 그들과의 호환성 U-2012 분석 결과를 사용하여 BSA 테스트와 같은 단백질이다. 사이 차아 염소산 나트륨 과 물 2,단지 물 2 차아 염소산염의 존재 하에서 침전물이 형성됨에 따라 양립 할 수 있었다. 펠릿에 있는 잔여 산의 충분한 중화 후에 유-2012 에 의해 침전된 단백질은 분석될 수 있습니다. 단백질 침전에 대한 단백질 침전에 대한 단백질 침전의 우월성이보고되었습니다(24,25). 에 대조적으로,우리의 비교 평가,유사한 공개 C50 값 PCA(1.395)및 TCA(1.400). 우리는 사전 제작 된 용액(70%브이/브이)으로 쉽게 사용할 수 있기 때문에 필요한 강도로 쉽게 희석 할 수 있기 때문에 선호했습니다. 물 함량이 변하기때문에 정확하게 무게를 측정하기 어려운 흡습성 고체입니다.

두 가지 방법이 있습니다. “처리 된”단백질의 경우 물 처리 처리 및”역 처리 된”단백질의 경우 물 처리 우선 물 처리 침전. ‘처리’단백질을 사용 하 여의 장점은 다양 한 상청 액 및 샘플 준비 하는 동안 단백질 분해 효소의 가능한 불 활성화 방해 물질의 제거 했다. 이것은 처리 및 역 처리 된 트립신 및 역 처리 된 트립신을 분석하여 확인되었습니다(표 1 참조). 처리 된 샘플 만 착색 된 생물학적 샘플의 실제 단백질 함량을 결정하는 데 사용되었습니다

표 1. 다양한 단백질 표준 곡선의 3 점 매개 변수.

유색 시료의 처리 및 수소는 모두 유-2012 분석실험에서 간섭 제거를 위해 필요했다. 컬러 샘플의 산 침전 혼자 간섭을 완전히 제거 하지 않았다. 모든 착색한 견본으로,어떤 색깔은 상청액에서 버려졌습니다,그러나 펠릿은 또한 착색되었습니다. 컬러는 물 처리에 의해 펠릿으로부터 제거되었다. 알칼리성 조건은 단백질 수준이 정확하게 측정된다는 것을 보증하기 위하여 물 2(26)에 의하여 효과적인 탈색 및 폴린의 시약에 의하여 색깔 발달 둘 다를 위해 요구되었습니다. 나오와 코 모두 필요한 알칼리성을 제공 할 수 있지만,나오 만이 유-2012 분석과 호환되었습니다. 석출물은 코 존재 하에서 형성되었다. 에서 펠렛,PCA 중화를 사용하여 Na2CO3 및 NaOH(27). 추가 수산화 나트륨 추가되었는 동안 분석;최적화된 볼륨 사이 50~70µL(60μl 었는 정기적으로 사용되는);그림 1 을 참조하십시오.

비트 뿌리,블루 베리 및 적포도주를 각각 50 도 및 실온에서 0.5 및 2 시간 복용 30%의 15%로 탈색 하였다. 더 강한 착색 된 샘플에 대처하기 위해 사용되었다. 상온 처리가 단백질 함량을 과대 평가함에 따라 중요한 것으로 보인다. 부 끄 러운,50 의 경우 14%처리 처리 되지 않은,실 온 처리만 절반 그 추정치의 명백한 단백질 추정치를 감소 하는 반면.

과산화수소 처리 후 실시한 비색 분석 결과에서 일부 물 2 가 탈색에 사용되지 않았음이 분명했다. 이러한 샘플에서,로리 분석의 끝 색이 부분적으로 파괴되었다. 따라서 단백질 분석 전에 남은 과산화수소를 파괴 할 필요가있었습니다. 트리톤 엑스-100(0.22%,제품 정보:트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100,트리톤 엑스-100www.sigmaaldrich.com).과산화수소는 일반적으로 효소 카탈라아제에 의해 분해됩니다. 그러나 단백질 분석의 높은 산도는 알려진 카탈라아제를 비활성화시킬 것입니다. 또한 카탈라아제를 첨가하면 여분의 단백질을 첨가 할 수 있습니다. 우리는 피루브산(28)을 사용하여 물 2 의 화학적 파괴를 선택했습니다. 피루브산-물 상호 작용 방정식의 화학은 잘 확립되어있다(28,29). 피루브산염은 다음 반응에 따라 실온에서 물 2 를 파괴합니다:

상온에서 0.5 시간 동안 0.9 미터 피루브산(1.5 배 농도)으로 처리함으로써 펠렛 현탁액 중의 잔류 수소를 파괴하였다. 트리톤 엑스-100 에 있는 오염물질을 방해하기 위하여,여분 피루브산염은 또한 단백질 분석실험에서 추가되었습니다(숫자 1). 피루 베이트의 첨가는 비 단백질 블랭크에 대해 더 낮은 흡광도를 주었다. 트리톤 엑스-100 의 과산화물 오염 물질이 용액-2 의 아세토니트릴과 반응하여 약간 더 높은 흡수성을 제공하는 것이 좋습니다.

착색된 생물학적 샘플과 관련된 색 간섭은 폴린의 시약이 없는 상태에서 단백질 분석을 실행함으로써 단순히 고려될 수 없다. 또한,샘플 색상의 간섭이 적포도주(=40)의 경우 가장 높고 블루베리(=6)및 비트 뿌리(=2)의 경우 더 적다는 것을 나타냈다. 이 간섭은 진정한 단백질 수준의 비정상적으로 높은 추정치로 번역되었습니다;예를 들어,처리되지 않은 가공 된 비트 뿌리 균질화를 사용하는 단백질의 농도(각각 20.21 대 2.89 밀리그램 단백질/그램 조직). 색상 간섭 외에도 적포도주와 비트 뿌리 및 블루 베리의 균질물에는 폴린의 시약과 반응 할 물질이 포함될 가능성이 있습니다.지.,작은 펩티드 및 복잡한 설탕). 이들은 선택적으로 5%의 최종 농도로 얼음처럼 차가운 단백질(그림 1)을 침전시킴으로써 제거되었다.

표준 곡선 및 그 매개 변수

처리되지 않은 및 처리 된 표준 곡선은 그림 2 에 나와 있습니다. 또한,상기 유도된 파라미터들은 표 1 에 열거되어 있다.

결과는 모델의 잔여 표준 오차가 낮다는 것을 보여 주며(0.012~0.048)직사각형 쌍곡선 추세에 대한 데이터의 더 나은 적합을 나타냅니다. 다양한 단백질과 그 처리 사이의 정보를 비교하기 위해,매개 변수는 650 나노 미터(표 1 의 오른쪽 열)에서 흡광도=1.0 농도로 변환되었습니다.

이러한 결과는 처리 된 샘플에서 단백질의 손실(처리되지 않은 단백질과 비교)이 역 처리 된 샘플보다 적음을 보여줍니다. 이 손실은 트립신의 경우에 더 명백하고 반전 가공 도중 그것의 자동 촉매 활동을 기준으로 하여 설명될 수 있습니다. 우리는 단백질 분해 효소를 포함 할 가능성이있는 생물학적 샘플에 대해서만’처리 된’프로토콜(보충 자료)을 따르는 것이 좋습니다.1988(15)에서,단백질의 양에 대한 흡광도를 플로팅함으로써 얻어진 표준 곡선의 선형 부분만이 단백질의 정량적 측정에 사용되었다. 우리는 코클리와 제임스(20)와 일치 재료 및 방법 섹션에 설명 된대로 직사각형 쌍곡선 방정식을 피팅하여보다 효과적으로 데이터를 사용합니다.미지의 샘플에서 유색 균질산염의 단백질 농도

는 표 1 에 열거된 모든 가공 단백질의 평균 및 가공된 단백질의 평균에 대해 방정식에 의해 계산되었다. 후자는 단백질 혼합물을 포함하는 생물학적 샘플에 대한 진정한 추정에 더 가까울 것입니다. 우리는 레드 와인에 비해 블루 베리와 비트 뿌리의 단백질 양을 각각 약 60 배와 230 배로 추정했습니다(표 2).

표 2. 유색 생물학적 샘플의 단백질 함량 1

그 결과,블루베리의 적포도주 및 50%균질화물은 물 2 에 의한 침전 및 탈색에 의해 처리되었다(그림 1). 이 단계에서 생물학적 샘플은 적포도주의 경우 40 회,비트 뿌리와 블루 베리의 경우 4 회 농축되었습니다. 또한,투여 후 10-20 분 동안 투여 될 수있다. 상기 식에 의해 설명된 바와 같이,단백질 함량을 계산하기 위해 사용되었다.

결론적으로,유-2012 분석실험은 안정한 시약을 사용하고,향상된 감도(무색의 생물학적 시료에 대해서도)를 제공하고,유색 생물학적 시료에 대한 색 유도 간섭을 극복하였다. 마이크로소프트 엑셀 내의 간단한 절차를 사용하여 기준에 적합했던 직사각형 쌍곡선 곡선 모형을 통해 비선형 지구에 있는 자료의 능률적인 사용이 유-2012 년 분석실험에 의하여 단백질 농도와 흡수도 사이 응답의 선형 부분에 강요되지 않으며.