dette resulterer i kolorimetriske (absorbans) og fluorescens endringer. Resazurin er blått og ikke-fluorescerende, mens resorufin er rødt og sterkt fluorescerende. Det er en sensitiv analyse hvis du arbeider med høyere enn 5×103 celler per 100 µ, relativt giftfri og forutsatt at den utføres nøye, kan de samme replikatene følges over flere tidspunkter. Ulempen med denne analysen er at det ikke er en direkte celletellingsteknikk som heamocytometri, fordi fluorescens-eller absorbanssignalet kan påvirkes av både endringer i celletall og cellemetabolisme.
Materialer & Metoder
- 96 vel svarte polystyren mikroplater (Greiner Bio-One)
- alamarblue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH microplate reader
Humane Osteoblastceller Fra tidlig passasje (Kokeplate 406-05A), levert Av Den Europeiske Samlingen Av Cellekulturer ECACC, ble sådd på substrater A Og B med en tetthet på 104 per prøve. Prøvene ble hver plassert i en brønn med en 24-brønnplate, dekket med 1 ml kulturmedium og inkubert i totalt 17 dager. Kulturmediet var Mccoys 5a medium som inneholdt 10% varmeinaktivert serum, 1% glutamin og vitamin c (30 µ / mL).
for å måle celleproliferasjon ble de frøede substratene inkubert i 4 timer (lengre inkubasjonstider kan brukes for større følsomhet) med friskt kulturmedium supplert med 10 vol% alamarBlue®. Totalt 10 replikater ble brukt for hvert substrat.
etter inkubasjon ble 100 µ medium fra hver brønn overført til en 96-brønns svart polystyrenmikroplate og replikert 3 ganger. Fluorescens (eksitasjon 530 nm, utslipp 590 nm) ble målt på EN BMG LABTECH mikroplate leser. (Merk: Kolorimetrisk deteksjon kan overvåkes ved absorbansmålinger ved 570 nm, mens du bruker 600 nm som referansebølgelengde. Det har imidlertid en tendens til å være mindre følsomt fordi det er betydelig overlapping av oksiderte og reduserte former for alamarBlue® målt ved absorbans).
reduksjonen av alamarblue® med cellene uttrykt som fluorescens – utslippsintensitetsenheter ble målt på dager 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 og 17 av kulturperioden for forskjellige prøver. % Reduksjon av alamarBlue® for hvert tilfelle ble beregnet ved hjelp av formelen