TEXT
arseen is een klasse I carcinogeen voor de mens dat een gezondheidsrisico voor de mens inhoudt. Arseen blootstelling is gekoppeld aan huidkanker, blaaskanker, diabetes, hart-en vaatziekten, en perifere vasculaire ziekte (1, 2). Het U. S. Environmental Protection Agency (EPA) plaatst arseen op de eerste plaats op zijn Superfund lijst van gevaarlijke stoffen (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arseen komt vrij in het milieu door geothermische activiteit, door het oplossen van mineralen en door antropogene activiteiten zoals industrieel afvalwater, de verbranding van fossiele brandstoffen en het gebruik van arseenhoudende bestrijdingsmiddelen, herbiciden, houtconserveringsmiddelen en toevoegingsmiddelen voor diervoeding (3). Door het gebruik van met arseen verontreinigd irrigatiewater hoopt arseen zich op in rijst, het voedingsbestanddeel voor de helft van de wereldbevolking (4). Arseen methylering is een ontgiftingsroute (5, 6). Veel organismen hebben genen die arseniet S-adenosylmethionine (SAM) methyltransferasen coderen (arsm in microben en AS3MT in hogere organismen genoemd) die als(III) biotransformeren tot gemethyleerde soorten, met vluchtige niet-toxische trimethylarsine (7) als eindproduct (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida is een gramnegatieve bacterie die voorkomt in water en bodem, met name in de wortelzone bij een relatief hoge bevolkingsdichtheid (10). Dit micro-organisme is uitgebreid bestudeerd als model voor de biologische afbraak van aromatische verbindingen zoals naftaleen (11) en styreen (12, 13). Conventionele saneringsmethoden, zoals bodemafgraving gevolgd door coagulatiefiltratie of ionenuitwisseling, zijn duur, storend en worden niet veel gebruikt (14). Sphingomonas desiccabilis en Bacillus idriensis die arsM uitdrukken kunnen arseen uit verontreinigde grond verwijderen, maar expressie uit een plasmide beperkt hun nut (15). Pseudomonas-soorten hebben het vooruitzicht op rhizoremediatie van organische verbindingen (16), maar zijn niet gebruikt voor arseenverwijdering.
het doel van deze studie was het construeren van een stam van P. putida KT2440 met de mogelijkheid om arseen uit verontreinigde grond te verwijderen. We gebruikten het Chlamydomonas reinhardtii arsm gen dat codeert voor een Arsm orthologue (CrArsM). In vitro gezuiverd CrArsM geméthyleerd als (III)op een verscheidenheid aan soorten (zie Fig. S1A in het aanvullende materiaal). Na 7 uur werden methylarseniet en dimethylarsenaat in relatief gelijke hoeveelheden geproduceerd. Na 14 uur was het product voornamelijk DMAs(V), met kleinere hoeveelheden trimethylarsineoxide en geen MAs(III). Deze resultaten zijn consistent met opeenvolgende methylation stappen aan de mono-, di-, en trimethyl producten. TMAs (III)gas kon worden gedetecteerd op met H2O2 geïmpregneerde filters door oxidatie tot TMAs(V) O (zie Fig. S1B in het aanvullende materiaal). Deze resultaten tonen aan dat gezuiverd CrArsM drie opeenvolgende rondes van AS(III) methylering katalyseert en giftig anorganisch arseen omzet in minder toxische of niet-toxische organische arsenicals.
het C. reinhardtii arsM-gen achter de Kanamycin-promotor werd geïntegreerd in het chromosoom van P. putida KT2440, dat geen arsm-gen heeft en geen arseen methyleert. Minitransposonlevering plasmide pBAM1 werd gebruikt als een zelfmoordvector om stabiele integranten te genereren die arsm constitutief konden uitdrukken. Het arsm gen werd gekloond tot pBAM1 (zie Fig. S2 in het aanvullende materiaal) en vervolgens overgebracht van Escherichia coli CC118λpir naar P. putida KT2440 door tripartiete conjugatie met een hulpstam. Wild-type P. putida heeft twee chromosomale arsrbch operons en kan groeien in de aanwezigheid van 2 mM As (III), wat een concurrentievoordeel oplevert voor P. putida in verontreinigde grond (10). Dit kan een cruciale factor zijn voor het ondersteunen van de groei van cellen in aanwezigheid van inheemse bacteriële populaties (14). Cellen van P. putida KT2440 met expressie van CrArsM waren resistent tegen 7,5 tot 10 mM als (III) in vloeibaar basaal zout M9 medium (Fig. 1). Biotransformatie van arseen door de cellen werd bepaald met 25 µM als (III) of arsenaat (Fig. 2). Na 12 uur, geconstrueerde P. putida biomethyleerd als(III) voornamelijk aan DMA ‘ S (V) en, in mindere mate, methylarsenaat (Fig. 2 bis). Op een tijdafhankelijke manier produceerden de gemanipuleerde cellen dimethylarsine en tmas(III) gassen, geïdentificeerd door ze te oxideren tot DMAs(V) en TMAs (V)O met H2O2 (Fig. 2B). Bovendien werd het product van de methyleringsreactie gekwantificeerd in cellen van P. putida die CrArsM uitdrukken. Na 48 uur was het belangrijkste product in het kweekmedium DMA ‘S (V) (57% van het totale arseen), met kleinere hoeveelheden MAs (v) (31%) en nog minder TMA’ s (V)O (8%) (Fig. 2C). De transgene P. putida stam snel geméthyleerd Als (V) (Fig. 2A, curve 4). Er zijn twee arsrcbh operons in het chromosoom van P. putida, dus het is redelijk om aan te nemen dat de chromosomaal gecodeerde ARSC reductase snel verminderd als(V) tot As(III), het substraat van CrArsM, waardoor de bodembacterie zowel methyleren Als(V) en als(III).