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Arsénio é uma classe que eu carcinogénico para os humanos, que representa um risco para a saúde de seres humanos. A exposição ao arsênico está ligada ao câncer de pele, câncer de bexiga, diabetes, doença cardiovascular e doença vascular periférica (1, 2). A Agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (EPA) classifica o arsênico em primeiro lugar em sua lista Superfund de substâncias perigosas (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
o arsénio é libertado no ambiente pela actividade geotérmica, pela dissolução de minerais e por actividades antropogénicas tais como os efluentes industriais, a combustão de combustíveis fósseis e o uso de pesticidas contendo arsénio, herbicidas, conservantes de madeira e aditivos para a alimentação animal (3). Como resultado do uso de água de irrigação contaminada com arsênio, o arsênio acumula-se no arroz, o alimento básico para metade da população mundial (4). Metilação arsênica é uma via de desintoxicação (5, 6). Muitos organismos têm genes que codificam arsenite S-adenosylmethionine (SAM) methyltransferases (chamado de ArsM em micróbios e AS3MT nos organismos superiores) que biotransform Como(III) em metilado espécies, com volátil, tóxico trimethylarsine (7) como o produto final (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida é uma bactéria Gram-negativa encontrada em água e solo, particularmente na rizosfera com uma densidade populacional relativamente alta (10). Este microorganismo tem sido estudado extensivamente como um modelo para biodegradação de compostos aromáticos tais como naftaleno (11) e estireno (12, 13). Métodos convencionais de remediação, como escavação de solo seguida por filtração de coagulação ou troca de íons, são caros, disruptivos e não amplamente utilizados (14). Sphingomonas dessiccabilis e Bacillus idriensis expressing Arms podem remover o arsénio do solo contaminado, mas a expressão de um plasmídeo limita a sua utilidade (15). Pseudomonas species have the prospect of rhizoremediation of organic compounds (16) but have not been used for arsenic removal.
o objectivo deste estudo foi construir uma estirpe de P. putida KT2440 com potencial para remoção de arsénio do solo contaminado. Usámos o gene Chlamydomonas reinhardtii arsM a codificar um ortólogo ArsM (CrArsM). In vitro, CrArsM purificado metilado como III) numa variedade de espécies (ver Fig. S1A no material suplementar). Após 7 h, o metilarsenito e o dimetilarsenato foram produzidos em quantidades relativamente iguais. Após 14 h, o produto era principalmente DMAs (V), com quantidades menores de óxido de trimetilarsina e no MAs(III). Estes resultados são consistentes com os passos de metilação sequencial para os produtos mono-, di-e trimetil. Gás TMAs (III)pode ser detectado em filtros impregnados de H2O2 por oxidação para TMAs(V) O (ver Fig. S1B no material suplementar). Estes resultados demonstram que a purificado CrArsM catalisa três rodadas sequenciais de Como(III) a metilação e converte tóxicos de arsênico inorgânico para menos tóxico ou atóxico orgânica arsenicals.
o gene C. reinhardtii arsM por trás do promotor da canamicina foi integrado no cromossoma de P. putida KT2440, que não possui um gene arsM e não metila arsénio. Minitransposon delivery plasmid pBAM1 was used as a suicide vector to generate stable integrants that could express arms constitutively. O gene arsM foi clonado em pBAM1 (ver Fig. S2 no material suplementar) e subsequentemente transferido de Escherichia coli CC118λpir para P. putida KT2440 por conjugação tripartida com uma estirpe auxiliar. O tipo selvagem P. putida tem dois operões de arnsch cromossómicos e pode crescer na presença de 2 mM As III, O que proporciona uma vantagem competitiva a P. putida em solo contaminado (10). Este pode ser um fator crucial para sustentar o crescimento de células na presença de populações bacterianas indígenas (14). Células de P. putida KT2440 expressando CrArsM foram resistentes a 7,5 a 10 mM como III) em meio líquido basal de sal M9 (Fig. 1). A biotransformação do arsénio pelas células foi determinada com 25 µM como (III) ou arsenato (Fig. 2). Depois de 12 h, foi projetado P. putida biometilado como(III) principalmente para DMAs (V) e, em menor grau, metilarsenato (Fig. 2A). De forma dependente do tempo, as células projetadas produziram gases de dimetilarsina e TMAs (III), identificados pela oxidação em DMAs(V)e TMAs(V) o com H2O2 (Fig. 2B). Além disso, o produto da reacção de metilação foi quantificado em células de P. putida expressando CrArsM. Após 48 h, o principal produto encontrado no meio de cultura foi DMAs(V) (57% do arsênio total), com quantidades menores de MAs(v) (31%) e ainda menos TMAs(V)O (8%) (Fig. 2C). A estirpe transgénica P. putida rapidamente metilou-se como(V) (Fig. 2A, curva 4). Existem dois operões arsRCBH no cromossomo P. putida, por isso, é razoável assumir que a redutase ArsC codificada cromossomicamente reduziu rapidamente como(V) A(III), o substrato de CrArsM, permitindo que a bactéria do solo metileasse tanto como(V) e como(III).