detta resulterar i kolorimetriska (absorbans) och fluorescensförändringar. Resazurin är blått och icke-fluorescerande medan resorufin är rött och mycket fluorescerande. Det är en känslig analys om man arbetar med högre än 5×103-celler per 100 oc, relativt giftfri och förutsatt att den utförs noggrant, kan samma replikat följas över flera tidpunkter. Nackdelen med denna analys är att det inte är en direkt cellräkningsteknik som heamocytometri, eftersom fluorescens-eller absorbanssignalen kan påverkas av både förändringar i cellnummer och cellmetabolism.
Material & metoder
- 96 brunnsvart polystyren microplates (Greiner Bio-One)
- alamarBlue (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH microplate reader
tidig passage humana osteoblastceller (HOb 406-05a), som levereras av den europeiska samlingen av cellkulturer ECACC såddes på substrat A och B vid en densitet av 104 per prov. Proverna placerades var och en i en brunn av en 24-brunnsplatta, täckt med 1 ml odlingsmedium och inkuberades i totalt 17 dagar. Odlingsmediet var McCoys 5A-medium innehållande 10% värmeinaktiverat serum, 1% glutamin och C-vitamin (30 kg/mL).
för att mäta cellproliferation inkuberades de seedade substraten i 4 timmar (längre inkubationstider kan användas för större känslighet) med färskt odlingsmedium kompletterat med 10 vol% alamarBlue GHz. Totalt användes 10 replikat för varje substrat.
efter inkubation överfördes 100 mikronil-medium från varje brunn till en 96-brunns svart polystyrenmikroplatta och replikerades 3 gånger. Fluorescens (excitation 530 nm, emission 590 nm) mättes på en BMG LABTECH mikroplattläsare. (Obs: kolorimetrisk detektion kan övervakas genom absorbansmätningar vid 570 nm, medan 600 nm används som referensvåglängd. Det tenderar emellertid att vara mindre känsligt eftersom det finns en avsevärd överlappning av de oxiderade och reducerade formerna av alamarBlue Millenium mätt med absorbans).
alamarblue-reduktionen av cellerna uttryckt som fluorescensutsläppsintensitetsenheter mättes på dagar 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 och 17 av kulturperioden för olika prover. Minskningen i procent av alamarblue-beloppet för varje enskilt fall beräknades med formeln