denne tutorial diskuterer grundlæggende aspekter af massespektrometri, der vil være nyttige for dig ved at beslutte de rigtige teknikker og målinger til dine forskningsprøver.
- Hvad er massespektrometri?
- massespektrometeret
- Ioniseringsmetoder
- Elektronpåvirkningionisering
- kemisk ionisering
- Matrice assisteret Laser Desorption
- atmosfærisk tryk kemisk ionisering
- Elektrosprayionisering
- analyse af ioner
- Tandem massespektrometri
- separationsmetoder til kobling med massespektrometri
Hvad er massespektrometri?
massespektrometri er en analytisk teknik, der involverer undersøgelsen i gasfasen af ioniserede molekyler med det formål at en eller flere af følgende:
- Molekylvægtbestemmelse
- strukturel karakterisering
- gasfase reaktivitetsstudie
- kvalitativ og kvantitativ analyse af komponenter i en blanding.
massespektrometri består grundlæggende af vejning af ioner i gasfasen. Det anvendte instrument kunne betragtes som en sofistikeret balance, der med høj præcision bestemmer masserne af individuelle atomer og molekyler. Afhængig af prøverne kemiske og fysiske egenskaber kan forskellige ioniseringsteknikker anvendes. En af hovedfaktoren ved valg af hvilken ioniseringsteknik der skal anvendes, er termolabilitet. For prøver, der ikke er demolabile og relativt Flygtige, kan ionisering såsom Elektronpåvirkning og/eller kemisk ionisering anvendes effektivt. For prøver, der er termolabile, såsom peptider, proteiner og andre prøver af biologisk interesse, skal bløde ioniseringsteknikker overvejes. Blandt de mest anvendte bløde ioniseringsteknikker er Elektrospray (ESI) og Matrice assisteret Laser Desorption (MALDI). Navnet givet til en bestemt massespekteknik peger normalt på den ioniseringsmetode, der anvendes.
Atom-og molekylmasser tildeles i forhold til massen af carbonisotopen, 12c, hvis atomvægt er defineret som nøjagtigt 12. Den faktiske masse på 12C er 12 Daltons, med en dalton er lig med 1.661 10-24 g. massen af et molekyle eller en ion kan præsenteres i Daltons (Da) eller kilodaltons (kDa).
massespektrometeret
massespektrometri bruger et instrument kaldet et massespektrometer. Hovedkomponenterne i et massespektrometer er:
- Indløbssystem (LC, GC, direkte sonde osv…)
- ionkilde (EI, CI, ESI, APCI, MALDI osv…)
- Masseanalysator (Kvadrupol, TOF, Ionfælde, magnetisk sektor)
- detektor (Elektronmultiplikator, Mikrokanalplader MCPs)
prøver kan indføres til massespektrometeret direkte via faststofprobe eller i tilfælde af blandinger ved hjælp af kromatografiindretningen (f.eks. gaskromatografi, væskekromatografi, Kapillærelektroforese osv…). En gang i kilden udsættes prøvemolekyler for ionisering. Ioner dannet i kilden (molekylære og fragmentioner) erhverver en vis kinetisk energi og forlader kilden. En kalibreret analysator analyserer derefter de passerende ioner som en funktion af deres masse til ladningsforhold. Forskellige slags analysator (er) kan bruges, magnetisk, Kvadrulpole, Ionfælde, Fourier-transformation, flyvetid osv…Ionstrålen, der forlader analysatorenheden, registreres derefter, og signalet registreres. Fælles ionisering metode akronymer omfatter:
- EI=Elektronpåvirkning;
- CI=kemisk ionisering;
- SIMS=sekundære ioner Massespecifikation;
- FAB=hurtig atombombardement;
- LDMS=Laser Desorptionsmassespecifikation;
- PDMS=Plasma Desorptionsmassespecifikation;
- TS=Termospray;
- AS=Aerospray;
- ESMS=Elektrospray Massespecifikation.
fælles masse analysator akronymer omfatter:
- EB=elektrostatisk-magnetisk;
- IT=ionfælde;
- K=Firpolet;
- TOF=flyvetid.
Ioniseringsmetoder
valg af den korrekte ioniseringsmetode til analyse af din prøve er ekstremt vigtig. Selvom vi kan tilbyde forslag, er det dit ansvar at forstå og vælge den eller de metoder, der passer til dine forskningsforbindelser.
- Elektronpåvirkning EI ionisering
- kemisk ionisering CI
- negativ Ion kemisk ionisering
- Elektrosprayioniseringsteknikker
- Matrice assisteret Desorption af laser (ikke tilbudt i Vores anlæg, men tilgængelig ellerhvor på campus)
- atmosfærisk tryk kemisk ionisering APCI
Elektronpåvirkningionisering
m + e-(70ev) —–> m+. + 2e-
EI ioniseringsmetode er egnet til ikke-termolabile forbindelser. Prøveens volatilitet er påkrævet. Prøvemolekyler i damptilstand bombarderes af hurtigt bevægende elektroner, konventionelt 70 eV energi. Dette resulterer i iondannelse. En elektron fra den højeste orbitalenergi løsnes, og som følge heraf dannes molekylære ioner. Nogle af disse molekylære ioner nedbrydes, og fragmentioner dannes. Fragmenteringen af en given ion skyldes det overskud af energi, det kræver inden for ioniseringen. Fragmentioner kan være ulige elektron eller endda elektron. Molekylære ioner dannet i elektronpåvirkningionisering er ulige elektronioner. Ulige elektronfragmentioner dannes ved direkte spaltning (f. eks. direkte spaltning af en C – C-binding). Selv elektronfragmentioner dannes ofte ved omlejring(f.eks. protonoverførsel). Prøve kan indføres til EI-kilden via en gaskromatografianordning, for eksempel i tilfælde af blandinger, eller direkte via en faststofprobeanordning. De nødvendige mængder til et eksperiment er normalt mindre end et mikrogram materiale.
EI-massespektre indeholder i de fleste tilfælde intense fragmentiontoppe og meget mindre intens molekylær iontop. Når den molekylære iontop ikke observeres i massespektret, kan kemisk ionisering anvendes for at få molekylær ioninformation. En nyttig regel til bestemmelse af, om en ion er en molekylær ion, er Nitrogenreglen.
Nitrogenregel: som angivet ovenfor er molekylære ioner dannet i EI-ionisering ulige elektronioner. Hvis deres observerede masse til ladningsforhold er ulige, indeholder det undersøgte molekyle et ulige antal nitrogenatomer. Hvis dette forhold mellem masse og ladning er et lige antal, indeholder molekylet ingen eller endda nitrogenatomer.
kemisk ionisering
for organiske kemikere er kemisk ionisering (CI) særlig nyttig teknik, når der ikke observeres nogen molekylær ion i EI-massespektrum, og også i tilfælde af bekræftelse af molekylær ionens masse til ladningsforhold. Kemisk ioniseringsteknik bruger stort set den samme ionkildeindretning som i elektronpåvirkning, undtagen, ci bruger stram ionkilde, og reagensgas. Reagensgas (f.eks. ammoniak) udsættes først for elektronpåvirkning. Prøveioner dannes ved interaktion mellem reagensgasioner og prøvemolekyler. Dette fænomen kaldes ionmolekylreaktioner. Reagensgasmolekyler er til stede i forholdet omkring 100:1 med hensyn til prøvemolekyler. Positive ioner og negative ioner dannes i CI-processen. Afhængigt af instrumentets opsætning (kildespændinger, detektor osv…) kun positive ioner eller kun negative ioner registreres.
i CI forekommer ionmolekylereaktioner mellem ioniserede reagensgasmolekyler (G) og flygtige analytneutrale molekyler (M) for at producere analytioner. Pseudomolekylær ion MH+ (positiv iontilstand) eller – (negativ iontilstand) observeres ofte. I modsætning til molekylære ioner opnået i EI-metoden forekommer MH+ og – detektion i højt udbytte, og der observeres mindre fragmentioner.
positiv iontilstand:
GH+ + M – – – – – > MH+ + G
negativ iontilstand:
– + M ——> – + G
disse enkle protonoverførselsreaktioner er ægte gasfase syre-Base processer i Bronsted-Lavrey forstand. En” stram ” ionkilde (tryk=0,1-2 torr) bruges til at maksimere kollisioner, hvilket resulterer i øget følsomhed. For at finde sted skal disse ionmolekylereaktioner være eksoterme. Protonoverførsel er en af de enkle processer, der observeres i positiv CI:
RH+ + M- – – – – > MH+ + R
en af de afgørende parametre i denne reaktion er protonaffiniteten. For at reaktionen skal forekomme, skal protonaffiniteten af molekylet M være højere end den af gasmolekylet. De vigtigste reagensgasser, der anvendes i CI, er: ammoniak, methan og isobutan. De overvejende dannede reaktanter er angivet i mekanismerne vist nedenfor. Valg af reagensgas påvirker omfanget af fragmentering af den kvasi-molekylære ion.
metan (positiv ion kemisk ionisering):
- CH4 + e —–> CH4+. + 2e ——> CH3+ + H.
- CH4+. + CH4 —–> CH5+ +CH3.
- CH4+. + CH4 —–> C2H5+ + H2 + H.
Isobutane (positive ion chemical ionization):
- i-C4H10 + e —–> i-C4H10+. + 2e
- i-C4H10+. + i-C4H10 ——> i-C4H9+ + C4H9 +H2
Ammonia (positive ion chemical ionization):
- NH3 + e —–> NH3+. + 2e
- NH3+. + NH3 ——> NH4+ + NH2.
- NH4 + + NH3 ———>N2H7+
i metan-positiv iontilstand kemisk ionisering de relevante observerede prøvetoppe er MH+, + og +; men hovedsageligt MH+. Dette svarer til masserne M + 1, M+29 og M+41.
i isobutan positiv iontilstand kemisk ionisering den observerede hovedtop er MH+.
i ammoniak positiv ion tilstand kemisk ionisering de vigtigste toppe observeret er MH+, og +. Hvis mere end et protonationssted er til stede, kan yderligere NH3-addukter ses svarende til +. Dette svarer til masserne M + 1, M+18 og M+35.
i nogle tilfælde kan protonerede dimerer eller andre addukter ses; tab af H2O efterfulgt af protonation eller adduktiondannelse ses for nogle klasser af forbindelser. Hvis det spektrum, du observerer, ikke ser ud til at vise de rigtige adduktioner eller viser omfattende fragmentering, skal du være forsigtig, når du prøver at fortolke resultaterne. Der er en overflod af data tilgængelige i litteraturen, der diskuterer kemiske ioniseringsmekanismer, der gælder for specifikke klasser af forbindelser.
to faktorer bestemmer valget af den reagensgas, der skal anvendes:
- Protonaffinitet PA
- energioverførsel
NH3 (ammoniak) er den mest anvendte reagensgas i CI på grund af den lave energioverførsel af NH4+ sammenlignet med CH5+ for eksempel. Med NH3 som reagensgas observeres normalt MH+ og MNH4+ (17 masseenheder forskel).
negativ Ion kemisk ionisering
tre mekanismer kan understreges:
- Elektronindfangningsreaktion på grund af opnåelse af langsomt bevægende “termaliserede” elektroner med lav energi, som kan overføres mere effektivt til prøvemolekyler.
- elektronoverførsel fra ioniseret reagensgas (f.eks. NH2 – kan overføre en elektron til et molekyle med en større elektronaffinitet end NH2).
- Reagensgasioner deltager i ægte CI-reaktioner (f.eks.
molekylære ioner observeret i negativ ion kemisk ionisering massespektre er normalt M – eller -.
Elektrosprayioniseringsmetode
blandt de mest anvendte sprayioniseringsteknikker er Elektrosprayionisering (ESI). Denne teknik er fortsat den valgte metode til analyse af termolabile kemikalier. Dens evner er veldokumenterede. Det bruger en elektrisk spænding mellem ESI-sondeudgangen (f.eks. kapillær) og tællerelektroden, som er placeret få millimeter fra sonden. Processen resulterer i dannelsen af stærkt ladede dråber direkte fra den infunderede opløsning. Multiplicer og / eller enkeltladede analytmolekyler desorbe fra de sprøjtede dråber og samples gennem resten af massespektrometeret. ESI er blevet kendetegnet for sin evne til at producere multipliceret ladede molekylære ioner fra en lang række polymerer, såsom protein-og DNA-fragmenter; det tillader også følsom påvisning af enkeltladede polære arter med lav molekylvægt, såsom lægemidler og lægemiddelmetabolitter. Dannelsen af positive eller negative ioner (afhængigt af tegnet på det anvendte elektriske felt) forekommer i højt udbytte. I den positive iontilstand protonerede og / eller alkaliadduktanalytmolekyler, der generelt observeres i massespektre. I den negative iontilstand observeres driftstoppe svarende til deprotonerede analytmolekyler. ESI beskrives som en meget “blød” ioniseringsteknik, hvor den omgivende badgas har en modererende virkning på de indre og translationelle energier af desorberede ioner.
fordele ved ESI:
- blød ioniseringsproces, så intakte molekylære ioner observeres
- ESI tillader produktion af multiplicerede ladede ioner. Dette resulterer i evnen til at analysere arter med meget høj molekylvægt ved hjælp af de mest tilgængelige masseanalysatorer (f.eks.
- ESI er en atmosfærisk trykproces. Dette gør det nemt at bruge og nemt at interface med HPLC og CE separation teknikker.
laser Desorption (MALDI)
massespektrometri teknik blev introduceret af Karas og Hillkamp i 1988 til ionisering af peptider og proteiner. Snart var der efter denne teknik i stand til at analysere andre typer biomolekyler, såsom oligosaccharider, glycolipider, nukleotider og syntetiske polymerer. I denne teknik er prøverne krystalliseret med et UV-absorberende stof kaldet matrice. For eksempel for proteiner er den valgte matrice ofte sinapinsyre. En 337 nm stråling fra nitrogenlaser anvendes mest. Laseren hjælper med at indføre energi i molekylærsystemet på en sådan måde, at termisk nedbrydning forhindres.
MALDI bruges ofte med time-of-Flight massespektrometre ( TOF ) på grund af den pulserende karakter af teknikken, og massen rækkevidde kapacitet. Molekylvægte op til få hundrede daltoner kunne måles. Sammenligning af MALDI og ESI ioniseringsteknikker blev forsøgt i de sidste par år. Efter min mening er disse to teknikker ikke konkurrencedygtige, men komplementære. Bare for at nævne nogle få, for arter med høj molekylvægt, MALDI fører til dannelsen af enkeltladede molekylære ioner, mens ESI tillader dannelse af multipliceret ladede molekylære ioner.
praktiske overvejelser:
- den endelige molforhold prøve / matrice er omkring eller omkring 1/5000.
- endelig koncentration af prøven er fra 1 til 10 pmol/ul
- vores erfaring med MALDI peger på et dynamisk område på 100 fmol/ul til få hundrede pmol/ul
- MALDI er relativt robust ioniseringsteknik, der tolererer brugen af salte og overfladeaktive stoffer og buffere. Selvom det er bedst at fjerne dem for bedre ydeevne.
peptid og Protein standarder for MALDI:
- Angiotensin II (humant) MVM: 1046, 2
- stof P (humant) MVM: 1347, 7
- Insulin (kvæg) MVM: 5733, 6
- cytokrom c (heste) MVM: 12.360.1
- RNase A (kvæg) mv: 13,682.2
- Apo-Myoglobin (heste) : 16,951.5
- Trypsinogen (kvæg) : 23,980.9
atmosfærisk tryk kemisk ionisering
APCI er en teknik, der skaber ioner ved atmosfærisk tryk. En prøveopløsning strømmer gennem et opvarmet rør, hvor det fordampes i en tåge og sprøjtes ind i en koronaudladning ved hjælp af nitrogenforstøvning. Prøvemolekylære ioniseres af ionmolekylereaktioner fra de ambiante koronaudladningioner. Ioner produceres i udledningen og ekstraheres i massespektrometeret. APCI er bedst egnet til relativt polære, semi-Flygtige prøver. Et APCI-massespektrum indeholdt normalt den kvasi-molekylære ion, – eller +.
analyse af ioner
det er muligt at bruge flere forskellige fysiske parametre til at opnå masseseparation. Almindelige typer masseanalysatorer diskuteres nedenfor. Hver har fordele og ulemper. I Vores anlæg har vi i øjeblikket Kvadrupol, Ionfælde, amd Time-of-Flight (TOF) massespektrometre.
magnetisk sektor massespektrometer
sektormassespektrometeret var en af de mest almindelige typer masseanalysatorer og sandsynligvis den mest kendte for den daglige videnskabsmand. I 1950 ‘ erne var de første kommercielle massespektrometre sektorinstrumenter. De består af en kombination af en stor elektromagnetisk og en slags elektrostatisk fokuseringsenhed. Forskellige producenter bruger forskellige geometrier. Figur 1 viser en skematisk af en standard ‘BE’ geometri dobbelt fokusering instrument. BE-konfigurationen kaldes også omvendt geometri sektor massespektrometer – det vil sige et instrument med dobbelt sektor bestående af en magnetisk sektor efterfulgt af en elektrostatisk sektor.
ioner kommer ind i instrumentet fra kilden (nederst til venstre), hvor de oprindeligt er fokuseret. De kommer ind i den magnetiske sektor gennem kildespalten, hvor de afbøjes i henhold til venstre-reglen. Ioner med højere masse afbøjes mindre end ioner med lavere masse. Scanning af magneten gør det muligt at fokusere ioner af forskellige masser på skærmens spalte. På dette stadium er ionerne kun adskilt af deres masser. For at opnå et spektrum af god opløsning, hvor alle ioner med samme m/å forekommer sammenfaldende som en top i spektret, skal ioner filtreres af deres kinetiske energier. Efter endnu et trin med fokusering kommer ionerne ind i den elektrostatiske sektor, hvor ioner af samme m/å har deres energifordeling korrigeret for og er fokuseret på det dobbelte fokuseringspunkt på detektorspalten.
Sektorinstrumenter havde enorme kommercielle succeser i 1950 ‘erne og 1960’ erne, da de var den eneste praktiske måde at opnå data i høj opløsning på. I de sidste 20 år eller deromkring, med de faldende priser på FTMS og udviklingen af højopløsningsalternativer (f.eks.
time-of-Flight massespektrometri (TOF-MS)
et time-of-flight massespektrometer bruger forskellene i transittid gennem en drivregion til at adskille ioner af forskellige masser. Det fungerer i en pulserende tilstand, så ioner skal produceres eller ekstraheres i pulser. Et elektrisk felt accelererer alle ioner til et feltfrit drivområde med en kinetisk energi af KVV, hvor k er ionladningen og V er den påførte spænding. Da ion kinetisk energi er 0. 5mv2, har lettere ioner en højere hastighed end tungere ioner og når detektoren i slutningen af drivområdet hurtigere.
Teori:
- K. E. = KVV
- 1/2 mv2 = KVV
- v = (2kvv / m)1/2
transittiden (t) gennem drivrøret er L / v, hvor L er længden af drivrøret
- t=L / (2V / m / k)1/2
skematisk af en lineær TOF-MS
denne skematiske viser ablation af ioner fra en fast prøve med en pulserende laser. Reflectron er en serie af ringe eller gitre, der fungerer som en ion spejl. Dette spejl kompenserer for spredningen i ionernes kinetiske energier, når de kommer ind i drivområdet og forbedrer instrumentets opløsning. Udgangen af en iondetektor vises på et oscilloskop som en funktion af tid til at producere massespektret.
Ion fælde
ioner skabt af elektronpåvirkning (EI), elektrospray (ESI) eller matrice-assisteret laser desorption (MALDI) ionisering er fokuseret ved hjælp af et elektrostatisk linsesystem i ionfælden. En elektrostatisk ionport pulserer åben (- V) og lukket (+V) for at injicere ioner i ionfælden. Pulseringen af ionporten adskiller ionfælder fra “stråle” – instrumenter såsom kvadrupoler, hvor ioner kontinuerligt kommer ind i masseanalysatoren. Den tid, hvor ioner er tilladt i fælden, betegnet “ioniseringsvarighed”, er indstillet til at maksimere signalet og samtidig minimere rumladningseffekter. Rumladning skyldes for mange ioner i fælden, der forårsager en forvrængning af de elektriske felter, hvilket fører til en samlet reduktion i ydelsen. Ionfælden fyldes typisk med helium til et tryk på ca. 1 mtorr. Kollisioner med helium dæmper ionernes kinetiske energi og tjener til hurtigt at samle baner mod midten af ionfælden, hvilket muliggør fangst af injicerede ioner. Fangede ioner fokuseres yderligere mod midten af fælden ved hjælp af et oscillerende potentiale, kaldet den grundlæggende rf , påført ringelektroden. En ion vil blive stabilt fanget afhængigt af værdierne for ionens masse og ladning, størrelsen af ionfælden (r), den oscillerende frekvens af den grundlæggende rf ( V) og amplituden af spændingen på ringelektroden ( V). Ionbevægelsens afhængighed af disse parametre er beskrevet af Den dimensionsløse parameter KS, KS = 4eV / mr2v2
Kvadrupol
et kvadrupol massefilter består af fire parallelle metalstænger arrangeret som i nedenstående figur. To modstående stænger har et anvendt potentiale på (U+VCO ‘er(vægt)), og de to andre stænger har et potentiale på -(U+VCO’ er(vægt)), hvor U er en jævnspænding og VCO ‘ er (vægt) er en vekselstrømsspænding. De anvendte spændinger påvirker banen for ioner, der bevæger sig ned ad flyvevejen centreret mellem de fire stænger. For givne dc-og ac-spændinger passerer kun ioner med et bestemt masse-til-ladningsforhold gennem firpol-filteret, og alle andre ioner smides ud af deres oprindelige sti. Et massespektrum opnås ved at overvåge ionerne, der passerer gennem firpol-filteret, da spændingerne på stængerne varieres. Der er to metoder: varierende V og holder U og V konstant eller varierende U og V (U/V) fastgjort til en konstant v.
et kvadrupol massefilter består af fire parallelle metalstænger arrangeret som i nedenstående figur. To modsatte stænger ha
Tandem massespektrometri:
Tandem massespektrometri, normalt benævnt MS/MS, indebærer anvendelse af 2 eller flere masseanalysatorer. Det bruges ofte til at analysere individuelle komponenter i en blanding. Denne teknik tilføjer specificitet til en given analyse. Selvom tandemmassespektrometri kan henvises til MS/MS, MS/MS/MS osv…
grundideen med MS/MS er et valg af en m/å af en given ion dannet i ionkilden og udsætter denne ion for fragmentering, normalt ved kollision med inert gas (f.eks. Argon). Produktionerne detekteres derefter. Dette er en stærk måde at bekræfte identiteten af visse forbindelser og bestemme strukturen af ukendte arter. Så MS / MS er en proces,der involverer 3 trin: ionisering,massevalg, masseanalyse.
MS/MS kunne udføres på instrumenter som f.eks… Den tredobbelte kvadrupol er det hyppigst anvendte massespektrometer til MS/MS, måske på grund af omkostningerne og brugervenligheden blandt andre faktorer.
separationsmetoder til kobling med Massespecifikation
- GC-MS: Prøveblandinger fordampes direkte og går ind i bundne smeltede silicakolonner. Komponenter af blandingen adskilles baseret på deres affinitetsforskel med den bundne fase. Adskilte forbindelser forlader søjlen og går ind i massespektrometerets vakuumsystem. Prøvemolekyler ioniseres (EI eller CI) og accelereres til en prækalibreret masseanalysator (f.eks…). Retentionstider, molekylmasser og fragmenteringsmønstre registreres. En af de vigtigste hensyn til GC / MS er, at prøven / prøverne skal være ikke-termolerbare, hvilket betyder termisk stabil.
- LC-MS: for forbindelser, der er termisk ustabile, overvejes LC/MS-metoden. Adskillelsen er baseret på diffrence i affinitet af prøver med stationær fase og den mobile fase. F. eks.hydrofobicitet i tilfælde af RP-kromatografi.
- CSE-MS: denne metode er baseret på forskelle i elektroforetisk mobilitet af prøver, når den smeltede silicasøjle er under en potentiel forskel mellem injektionssiden og detektorsiden.
- CIEF-MS: Dette er en variant af CSE. Det er baseret på diffrerencer i isoelektriske punkter af analytter.