Mass Spectrometry Tutorial (Dr. Kamel Harrata))

este tutorial discute aspectos básicos da espectrometria de massa que serão úteis para você na decisão das técnicas e medidas adequadas para suas amostras de pesquisa.O que é espectrometria de massa?

o Que é a Espectrometria de Massa?

espectrometria de Massa é uma técnica analítica que envolve o estudo na fase gás de moléculas ionizadas com o objetivo de um ou mais dos seguintes:

• determinação de pesos Moleculares
• caracterização Estrutural
• em fase gasosa e reactividade estudo
• análise Qualitativa e quantitativa dos componentes de uma mistura.

espectrometria de massa consiste basicamente em iões de pesagem na fase gasosa. O instrumento usado pode ser considerado como um equilíbrio sofisticado que determina com alta precisão as massas de átomos e moléculas individuais. Dependendo das propriedades químicas e físicas das amostras, diferentes técnicas de ionização podem ser usadas. Um dos principais fatores na escolha da técnica de ionização a ser usada é a termolabilidade. Para amostras que não são temolábeis e relativamente voláteis, ionização como impacto de elétrons e/ou ionização química pode ser efetivamente utilizada. Para amostras que são termolábeis, tais como peptídeos, proteínas e outras amostras de interesse biológico, técnicas de ionização suave devem ser consideradas. Entre as técnicas de ionização suave mais utilizadas estão o Electrospray (ESI) e a dessorção Laser assistida por matriz (MALDI). O nome dado a uma determinada técnica de espectrómetro de massa geralmente aponta para o método de ionização utilizado.As massas atômicas e moleculares são atribuídas em relação à massa do isótopo de carbono, 12C, cujo peso atômico é definido como exatamente 12. A massa real de 12C é de 12 daltons, com um dalton é igual a 1.661 10-24 g. A massa de uma molécula ou de um ião pode ser apresentada em daltons (Da) ou kilodaltons (kDa).

the Mass Spectrometer

Mass spectrometry uses an instrument called a mass spectrometer. Os principais componentes de um espectrómetro de massa são::

• sistema de admissão (LC, GC, sonda directa, etc…)
• fonte iónica (EI, CI, ESI, APCI, MALDI, etc…)
• analisador de Massa (Quadripolares, TOF, Ion Trap, Magnético Setor)
• Detector (Multiplicador de Elétrons, Micro Placas de Canal os mcps)

as Amostras podem ser introduzidas para o espectrômetro de massa diretamente através de sólidos sonda, ou, no caso de misturas, por intermédio da cromatografia de dispositivo (por exemplo, cromatografia gasosa, cromatografia Líquida, eletroforese Capilar, etc…). Uma vez na fonte, as moléculas de amostra são submetidas a ionização. Íons formados na fonte (íons moleculares e fragmentos) adquirem alguma energia cinética e deixam a fonte. Um analisador calibrado, em seguida, analisa os íons que passam como uma função de suas proporções de massa para carga. Diferente tipo de analisador(s) pode ser usado, magnético, Quadripla, armadilha iônica, transformada de Fourier, tempo de voo, etc…O feixe iônico que sai do conjunto do analisador é então detectado e o sinal é registrado. Comum de ionização método de siglas incluem:

• EI=Impacto de Elétrons;
• CI=Química de Ionização;
• SIMS=Secundária de Íons de Massa Espec;
• FAB=Rápido Bombardeio de átomos;
• LDMS=Laser de Dessorção de Massa Espec;
• PDMS=Plasma Dessorção de Massa Espec;
• TS = Termospray;
• AS = Aerospray;
• ESMS = Electrospray Mass Spec.

Comum de massa analisador de siglas incluem:

• EB=Eletrostática-Magnético;
• IT=íon trap;
• Q=Quadripolares;
• TOF=Tempo de Vôo.

Métodos de ionização

Selecção do método de ionização adequado para a análise da sua amostra é extremamente importante. Embora possamos oferecer sugestões, é sua responsabilidade entender e selecionar o(s) método (S) apropriado (S) para seus compostos de pesquisa.

• Elétron Impacto EI Ionização
• Química de Ionização CI
• Íon Negativo Química de Ionização
• Electrospray Ionization Técnicas
• Matrix Assisted Laser de Dessorção (não oferecidos em nossas instalações, mas estão disponíveis em outro lugar no campus)
• Pressão Atmosférica Química de Ionização APCI

Impacto de Elétrons de Ionização

M + e-(70eV) —–> M+. O método de ionização é adequado para compostos não termolábicos. É necessária a volatilidade da amostra. Moléculas de amostra em estado vapor são bombardeadas por elétrons em movimento rápido, convencionalmente 70 energia eV. Isto resulta em formação iônica. Um elétron da maior energia orbital é deslocado, e como consequência íons moleculares são formados. Alguns destes íons moleculares decompõem-se e os íons fragmentos formam-se. A fragmentação de um dado íon é devido ao excesso de energia que ele requer dentro da ionização. Os íons fragmentos podem ser elétrons ímpares ou mesmo elétrons. Íons moleculares formados em ionização por impacto eletrônico são íons eletrônicos ímpares. Iões de fragmentos de elétrons ímpares são formados por clivagem direta(e.g. clivagem directa de uma ligação C-C. Mesmo íons fragmentos de elétrons são frequentemente formados por rearranjo(por exemplo, transferência de prótons). A amostra pode ser introduzida na fonte IE através de um dispositivo de cromatografia em fase gasosa, por exemplo, no caso de misturas, ou directamente através de uma sonda sólida. As quantidades necessárias para uma experiência são geralmente inferiores a um micrograma de material.

EI massa espectra, na maioria dos casos, contêm picos iónicos fragmentos intensos e picos de iões moleculares muito menos intensos. Quando o pico do ião molecular não é observado no espectro de massa, ionização química pode ser usada para obter informações sobre iões moleculares. Uma regra útil para determinar se um íon é um íon molecular é a Regra do nitrogênio.Regra do nitrogênio :como indicado acima, íons moleculares formados na ionização são íons eletrônicos ímpares. Se a sua relação massa / carga observada for ímpar, a molécula em investigação contém um número ímpar de átomos de azoto. Se essa razão massa / carga é um número par, essa molécula não contém átomos de nitrogênio ou mesmo.

ionização Química

para químicos orgânicos, ionização Química (CI) é uma técnica especialmente útil quando nenhum íon molecular é observado no espectro de massa da IE, e também no caso de confirmar a razão massa / carga do íon molecular. A técnica de ionização química usa virtualmente o mesmo dispositivo de fonte de íons que no impacto de elétrons, exceto que CI usa fonte de íons apertados, e gás reagente. O gás reagente (por exemplo, amoníaco) é primeiro submetido a um impacto de electrões. Os iões da amostra são formados pela interacção dos iões do gás reagente e das moléculas da amostra. Este fenômeno é chamado de reações íon-moléculas. Moléculas de gás reagente estão presentes na razão de cerca de 100: 1 em relação às moléculas de amostra. Íons positivos e íons negativos são formados no processo de IC. Dependendo da configuração do instrumento (tensão de fonte, detector, etc…) somente íons positivos ou somente íons negativos são registrados.

In IC, ion molecule reactions occur between ionized reagent gas molecules (G) and volatile analyte neutral molecules (M) to produce analyte ions. Íon Pseudo-molecular MH+ (modo iônico positivo) ou – (modo iônico negativo) são frequentemente observados. Ao contrário dos íons moleculares obtidos no método EI, a detecção MH+ ocorre em alta produtividade e menos íons fragmentos são observados.

Positiva do íon modo:

GH+ + M ——> MH+ + G

modo de íons Negativos:

– + M ——> – + G

Estas simples de transferência de próton reações são verdadeiras em fase gasosa de Ácido-Base de processos no Bronsted-Lowrey sentido. Uma fonte iônica” apertada ” (pressão=0,1-2 torr) é usada para maximizar colisões que resultam em aumento de sensibilidade. Para ter lugar estas reações de moléculas iônicas devem ser exotérmicas. A transferência de protões é um dos processos simples observados em IC positivo:

RH+ + M —–> MH+ R

um dos parâmetros decisivos nesta reacção é a afinidade do protão. Para que a reação ocorra, a afinidade do próton da molécula M deve ser maior que a da molécula do gás. Os principais gases reagentes utilizados em CI são: amônia, metano e isobutano. Os íons reativos predominantes formados são dados nos mecanismos mostrados abaixo. A escolha do gás reagente afeta a extensão da fragmentação do íon quase-molecular.

metano (ionização química iónica positiva):

• CH4 + e —–> CH4+. + 2e ——> CH3+ + H.
• CH4+. + CH4 —–> CH5+ +CH3.
• CH4+. + CH4 —–> C2H5+ + H2 + H.

Isobutane (positive ion chemical ionization):

• i-C4H10 + e —–> i-C4H10+. + 2e
• i-C4H10+. + i-C4H10 ——> i-C4H9+ + C4H9 +H2

Ammonia (positive ion chemical ionization):

• NH3 + e —–> NH3+. + 2e
• NH3+. + NH3 ——> NH4+ + NH2.
• NH4+ + NH3 ———>N2H7+

na ionização química do modo iônico positivo ao metano, os picos de amostra relevantes observados são MH+, + e +; mas principalmente MH+. Isto corresponde às massas M+1, M+29 E M+41.

na ionização química do modo iónico positivo isobutano, o pico principal observado é MH+.

na ionização química do modo iónico positivo ao amoníaco, os principais picos observados são MH+ e +. Se estiver presente mais de um local de protonação, podem ser vistos adutos NH3 adicionais correspondentes a +. Isto corresponde às massas M+1, m+18 e M + 35.

Em alguns casos, protonated dímeros ou outros adducts pode ser visto; perda de H2O seguido por protonation ou produtos de adição de iões de formação é visto por algumas classes de compostos. Se o espectro que você observa não parece mostrar os íons de aduto adequado, ou mostra fragmentação extensa, seja cauteloso quando você tentar interpretar os resultados. Há uma abundância de dados disponíveis na literatura discutindo mecanismos de ionização química aplicáveis a classes específicas de compostos.

dois factores determinam a escolha do gás reagente a utilizar:

1. afinidade ao protão PA
2. transferência de energia

NH3 (amoníaco) é o gás reagente mais utilizado EM IC devido à transferência de baixa energia de NH4+, comparado com CH5+, por exemplo. Com NH3 como gás reagente, geralmente MH+ e MNH4+ (diferença de 17 unidades de massa) são observados.

ionização Química negativa

três mecanismos podem ser sublinhados:

1. reação de captura de elétrons devido à obtenção de elétrons em movimento lento, de baixa energia “termalizados” que podem ser transferidos de forma mais eficiente para amostras de moléculas.
2. transferência de elétrons do gás reagente ionizado (por exemplo, NH2 – pode transferir um elétron para uma molécula com maior afinidade eletrônica do que NH2).Os íons de gás reagente participam em reações de CI verdadeiras (por exemplo, abstração de prótons, de acordo com as acididades relativas).

iões moleculares observados em espectros de massa de ionização química negativa são geralmente m – ou -.

método de ionização por Electrospray

entre as técnicas de ionização por pulverização mais utilizadas está a ionização por Electrospray (ESI). Esta técnica continua a ser o método de escolha para analisar produtos químicos termolábeis. As suas capacidades estão bem documentadas. Utiliza uma tensão elétrica entre a saída da sonda ESI (por exemplo, capilar) e o eletrodo do contador, que está localizado a poucos milímetros da sonda. O processo resulta na geração de gotículas altamente carregadas diretamente a partir da solução perfundida. Multiplicar e / ou carregar individualmente as moléculas de analito dessorbe a partir das gotículas pulverizadas e amostradas através do resto do espectrómetro de massa. A ESI tem sido distinguida por sua capacidade de produzir íons moleculares multiplicados a partir de uma grande variedade de polímeros, tais como proteínas e fragmentos de DNA; ela também permite a detecção sensível de espécies polares de baixo peso molecular individualmente carregadas, tais como drogas e metabolitos de drogas. A formação de íons positivos ou negativos (dependendo do sinal do campo elétrico aplicado) ocorre em alto rendimento. No modo iónico positivo, as moléculas do analito de adutos alcalinos e/ou protonados observam-se geralmente nos espectros de massa. No modo de Íon Negativo, os picos correspondentes a moléculas de analito desprotonado são observados. ESI é descrita como uma técnica de ionização muito” suave”, onde o gás do banho circundante tem um efeito moderador sobre as energias internas e translacionais de íons desalinhados.Vantagens da ESI:

• o processo de ionização suave de modo que íons moleculares intactos são observados
• ESI permite a produção de íons carregados multiplicados. Isto resulta na capacidade de analisar espécies de peso molecular muito elevado utilizando os analisadores de massa mais disponíveis (por exemplo, quadrupolos).ESI é um processo de pressão atmosférica. Isso torna fácil de usar e fácil de interface com as técnicas de separação HPLC e CE.

Matrix Assisted Laser de Dessorção (MALDI)

Matrix Assisted Laser de Dessorção (MALDI) técnica de espectrometria de massa foi introduzido por Karas e Hillkamp, em 1988, para a ionização de peptídeos e proteínas. Logo depois desta técnica foi capaz de analisar outros tipos de biomoléculas, tais como oligossacarídeos, glicolípidos, nucleótidos e polímeros sintéticos. Nesta técnica, as amostras são cocristalizadas com uma substância absorvente de UV chamada matrix. Por exemplo, para as proteínas, a matriz de escolha é frequentemente ácido sinapínico. A radiação de 337 nm a partir de laser de nitrogênio é mais comumente usado. O laser ajuda a introduzir energia no sistema molecular de forma a evitar a decomposição térmica.

MALDI é frequentemente usado com espectrómetros de massa de tempo de voo (TOF ) devido à natureza pulsante da técnica, e a capacidade de alcance de massa. Pesos moleculares até algumas centenas de daltons poderiam ser medidos. A comparação das técnicas de ionização MALDI e ESI foi tentada nos últimos anos. Na minha opinião, estas duas técnicas não são competitivas, mas complementares. Apenas para citar alguns, para espécies de alto peso molecular, MALDI leva à formação de íons moleculares carregados individualmente, enquanto ESI permite a formação de íons moleculares multiplicados.

considerações práticas:

• a amostra/matriz da razão molar final é de cerca de 1/5000 ou cerca de 1/5000.
• Final de concentração da amostra é de 1 a 10 pmol/ul
• Nossa experiência com MALDI aponte para uma gama dinâmica de 100 fmol/ul para algumas centenas pmol/ul
• MALDI é relativamente robusto de ionização técnica que tolera o uso de sais e surfactantes e buffers. Embora seja melhor removê-los para melhor desempenho.

peptídeos e Proteínas Normas para MALDI:

• a Angiotensina II (humanos) MW: 1046.2
• Substância P (humanos) MW: 1347.7
• Insulina (bovino) MW: 5733.6
• Cytochrom c (equinos) MW: 12,360.1
• RNase A (bovinos) MW: 13,682.2
• Apo-Mioglobina (equinos) MW: 16,951.5
• Tripsinogênio (bovino) MW: 23,980.9

Pressão Atmosférica Ionização Química

APCI é uma técnica que cria íons à pressão atmosférica. Uma solução de amostra flui através de um tubo aquecido onde é volatilizado em uma névoa e pulverizado em uma descarga de corona com o auxílio de nebulização de nitrogênio. Amostras moleculares são ionizadas por reações moleculares iônicas dos íons de descarga de corona ambiant. Iões são produzidos na descarga e extraídos no espectrômetro de massa. A APCI é mais adequada para amostras relativamente polares e semi-voláteis. Um espectro de massa APCI geralmente continha o íon quase-molecular, – ou +.

Análise de íons

é possível utilizar vários parâmetros físicos diferentes para a separação da massa. Os tipos comuns de analisadores de massa são discutidos abaixo. Cada um tem vantagens e desvantagens. Na nossa instalação temos actualmente espectrómetros de massa Quadrupole, iões, tempo amd de voo (TOF). Espectrómetro de massa do sector magnético

o espectrômetro de massa do setor foi um dos tipos mais comuns de analisador de massa e provavelmente o mais familiar para o cientista cotidiano. Nos anos 50, os primeiros espectrómetros comerciais de massa eram instrumentos sectoriais. Eles consistem de alguma combinação de um grande eletromagnético, e algum tipo de dispositivo de focagem eletrostática. Diferentes fabricantes usam geometrias diferentes. A figura 1 mostra um esquema de um instrumento de dupla focagem de geometria padrão “BE”. A configuração da BE também é chamada de espectrômetro de massa do setor de geometria reversa-ou seja, um instrumento de setor duplo consistindo de um setor magnético seguido por um setor eletrostático.

íons digitar o instrumento a partir da fonte (inferior esquerda) onde eles são inicialmente focados. Entram no sector magnético através da fenda da fonte, onde são desviados de acordo com a regra da mão esquerda. Iões de massa superior são desviados menos que iões de massa inferior. A digitalização do íman permite que íons de massas diferentes sejam focados na fenda do monitor. Nesta fase, os íons foram separados apenas por suas massas. Para obter um espectro de boa resolução onde todos os íons com o mesmo m/z aparecem coincidentes como um pico no espectro, os íons têm que ser filtrados por suas energias cinéticas. Após outra fase de focalização, os íons entram no setor eletrostático, onde os íons do mesmo m/z têm suas distribuições de energia corrigidas e são focados no ponto de foco duplo na fenda do detector.Os instrumentos do setor tiveram grandes sucessos comerciais nos anos 1950 e 1960, pois eram a única forma prática de obter dados de alta resolução. Nos últimos 20 anos, mais ou menos, com a diminuição dos preços dos FTMS e o desenvolvimento de alternativas de alta resolução (por exemplo, Q-Tof) estão em declínio.

espectrometria de massa de tempo de voo (TOF-MS)

um espectrómetro de massa de tempo de voo utiliza as diferenças no tempo de trânsito através de uma região de deriva para separar iões de massas diferentes. Funciona em modo pulsado, por isso os íons devem ser produzidos ou extraídos em pulsos. Um campo elétrico acelera todos os íons em uma região de deriva livre de campo com uma energia cinética de qV, onde q é a carga iônica e V é a tensão aplicada. Uma vez que a energia cinética iônica é 0, 5mv2, íons mais leves têm uma velocidade maior do que íons mais pesados e chegam ao detector no final da região de deriva mais cedo.

Teoria:

• K. E. = qV
• 1/2 mv2 = qV
• v = (2qV/m)1/2

O tempo de trânsito (t) através do desvio do tubo é de L/v, onde L é o comprimento da deriva tubo

• t=L / (2V/m/q)1/2

desenho Esquemático de um linear TOF-MS

Este esquema mostra a ablação de íons a partir de uma amostra sólida, com um laser pulsado. O reflectron é uma série de anéis ou grades que atuam como um espelho iônico. Este espelho compensa a propagação das energias cinéticas dos íons à medida que entram na região de deriva e melhora a resolução do instrumento. A saída de um detector de iões é exibida em um osciloscópio como uma função do tempo para produzir o espectro de massa.

Armadilha iónica

iões criados por impacto de elétrons (EI), eletrospray (ESI), ou dessorção laser assistida por matriz (MALDI) ionização são focados usando um sistema eletrostático de tensão para a armadilha de íons. Um portal de iões electrostático se abre (- V) e se fecha (+V) para injetar íons na armadilha de iões. O pulsar da porta iônica diferencia as armadilhas iônicas de instrumentos de “feixe”, como quadrupolos, onde iões continuamente entram no analisador de massa. O tempo durante o qual iões são permitidos na armadilha, chamado de “duração de ionização”, é definido para maximizar o sinal enquanto minimiza os efeitos de carga de espaço. A carga de espaço resulta de muitos íons na armadilha que causam uma distorção dos campos elétricos levando a uma redução global do desempenho. A armadilha de íons é normalmente preenchida com hélio a uma pressão de cerca de 1 mtorr. Colisões com hélio amortecem a energia cinética dos íons e servem para contrair rapidamente trajetórias em direção ao centro da armadilha de íons, permitindo a captura de íons injetados. Iões presos são ainda mais focados em direção ao centro da armadilha através do uso de um potencial oscilante, chamado de rf fundamental , aplicado ao eletrodo do anel. Um íon será estavelmente preso dependendo dos valores para a massa e carga do íon, o tamanho da armadilha de íons (r), a frequência oscilante da rf fundamental ( w), e a amplitude da tensão no eletrodo anel ( V). A dependência de iões de movimento sobre estes parâmetros é descrito pelo parâmetro adimensional qz, qz = 4eV/mr2w2

Quadripolares

Um quadripolares massa de filtro consiste de quatro paralelo hastes de metal dispostas como na figura abaixo. Duas hastes opostas têm um potencial aplicado de (U+Vcos(wt)) e as outras duas hastes têm um potencial de- (U+Vcos (wt)), onde U é uma tensão de CC e Vcos (wt) é uma tensão de CA. As tensões aplicadas afetam a trajetória de íons que percorrem a trajetória de voo centrada entre as quatro hastes. Para determinadas tensões dc e Ca, apenas íons de uma determinada razão massa-carga passam através do filtro quadrupol e todos os outros íons são expulsos de seu caminho original. Um espectro de massa é obtido monitorando os íons que passam através do filtro quadrupol como as tensões nas hastes são variadas. Existem dois métodos: variável w e mantendo U E V constantes, ou variável U E V (U/V) fixados para uma constante W.

um filtro de massa quadrúpede consiste em quatro barras metálicas paralelas dispostas como na figura abaixo. Duas hastes opostas ha

Tandem espectrometria de massa:

espectrometria de massa Tandem, geralmente referida como MS/MS, envolve o uso de 2 ou mais analisadores de massa. É frequentemente usado para analisar componentes individuais em uma mistura. Esta técnica adiciona especificidade a uma dada análise. Embora a espectrometria de massa em tandem possa ser referida a MS / MS, MS/MS/MS, etc…, nesta apresentação eu vou descrever apenas MS / MS.

a idéia básica de MS/MS é uma seleção de um M/z de um dado íon formado na fonte de íons, e sujeita este íon à fragmentação, geralmente por colisão com gás inerte (eg. Argon). Os iões do produto são então detectados. Esta é uma forma poderosa de confirmar a identidade de certos compostos e determinar a estrutura de espécies desconhecidas. Então MS / MS é um processo que envolve 3 etapas: ionização,seleção de massa, análise de massa.

MS / MS pode ser realizada em instrumentos como tripla quadrupole (QQQ), armadilha iônica, tempo de voo, transformada de fourier, etc… O quadrupolo triplo é o espectrômetro de massa mais usado para MS/MS, talvez por causa do custo e facilidade de uso entre outros fatores.

Métodos de separação para acoplamento com espectrómetro de massa

• GC-MS: As misturas de amostras são directamente vaporizadas e entram em colunas de sílica fundidas. Os Componentes da mistura são separados com base na sua diferença de afinidade com a fase ligada. Os compostos separados saem da coluna e entram no sistema de vácuo do espectrómetro de massa. As moléculas de amostra são ionizadas (EI, ou CI), e aceleradas para um analisador de massa pré-calibrado (por exemplo, Q, Ion Trap, TOF, FTMS, etc…). Tempos de retenção, massas moleculares e padrões de fragmentação são registrados. Uma das considirações mais importantes de GC / MS é que a(s) amostra (S) deve (M) ser não termolável, ou seja, termicamente estável.
• CL-MS: para compostos termicamente instáveis, considera-se o método LC/MS. A separação é baseada na diferença na afinidade das amostras com a fase estacionária e a fase móvel. por exemplo, hidrofobicidade em caso de cromatografia PR.
• CZE-MS: este método baseia-se em diferenças de mobilidade electroforética das amostras quando a coluna de sílica fundida está sob uma diferença potencial entre o lado da injecção e o lado do detector.
• CIEF-MS: esta é uma variante do CZE. É baseado em differências em pontos isoelétricos de analitos.