Massespektrometri Tutorial (Dr. Kamel Harrata)

denne opplæringen drøfter grunnleggende aspekter av massespektrometri som vil være nyttig for deg i å avgjøre de riktige teknikker og målinger for din forskning prøver.

• Hva Er Massespektrometri?
• Massespektrometeret
• Ioniseringsmetoder
  • Elektron Innvirkning Ionisering
  • Kjemisk Ionisering
  • Matriseassistert Laser Desorpsjon
  • Atmosfærisk Trykk Kjemisk Ionisering
  • Elektrospray Ionisering
• Analyse Av Ioner
• Tandem Massespektrometri
• Separasjonsmetoder For Kobling Med Massespec

Hva Er Massespektrometri?

Massespektrometri Er En analytisk teknikk som involverer studien i gassfasen av ioniserte molekyler med sikte på ett eller flere av følgende:

• Molekylvektbestemmelse
• Strukturell karakterisering
• Gassfase reaktivitet studie
• Kvalitativ og kvantitativ analyse av komponenter i en blanding.

Massespektrometri består i utgangspunktet av veiing av ioner i gassfasen. Instrumentet som brukes kan betraktes som en sofistikert balanse som bestemmer med høy presisjon massene av individuelle atomer og molekyler. Avhengig av prøvene kjemiske og fysiske egenskaper, kan forskjellige ioniseringsteknikker brukes. En av hovedfaktorene ved å velge hvilken ioniseringsteknikk som skal brukes, er termolabilitet. For prøver som ikke er molabile og relativt flyktige, kan ionisering som Elektronpåvirkning og/Eller Kjemisk Ionisering effektivt brukes. For prøver som er termolabile som peptider, proteiner og andre prøver av biologisk interesse, skal myke ioniseringsteknikker vurderes. Blant de mest brukte myke ioniseringsteknikkene er Elektrospray (ESI) og Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI). Navnet gitt til en bestemt massespesifikk teknikk peker vanligvis på ioniseringsmetoden som brukes.

Atomiske og molekylære masser er tilordnet i forhold til massen av karbonisotopen, 12C, hvis atomvekt er definert som nøyaktig 12. Den faktiske massen AV 12C er 12 dalton, med en dalton er lik 1.661 10-24 g. massen av et molekyl eller en ion kan presenteres i daltons (Da) eller kilodaltons (kDa).

Massespektrometeret

massespektrometri bruker et instrument kalt et massespektrometer. Hovedkomponentene til et massespektrometer er:

• Innløp system (LC, GC, Direkte sonde etc…)
• Ion kilde (EI, CI, ESI, APCI, MALDI, etc…)
• Masseanalysator (Quadrupole, TOF, Ionfelle, Magnetisk Sektor)
• Detektor (Elektronmultiplikator, Mikrokanalplater MCPs)

Prøver kan innføres til massespektrometeret direkte via faststoffprobe, eller i tilfelle av blandinger, ved mellomledd av kromatografiinnretning(F. eks. gasskromatografi, Væskekromatografi, Kapillærelektroforese, etc…). En gang i kilden blir prøvemolekyler utsatt for ionisering. Ioner dannet i kilden (molekylære og fragmentioner) får litt kinetisk energi og forlater kilden. En kalibrert analysator analyserer deretter passerende ioner som en funksjon av deres masse å lade ratio. Ulike typer analysator (er) kan brukes, Magnetisk, Quadrulpole, Ionfelle, Fourier Transform, Flytid, etc…Ionstrålen som går ut av analysatorenheten, oppdages da og signalet registreres. Vanlige ioniseringsmetode akronymer inkluderer:

• EI=Elektron Innvirkning;
• CI=Kjemisk Ionisering;
• SIMS=Sekundære Ioner Massespec;
• FAB=Rask Atombombardement;
• LDMS=Laser Desorpsjon Massespec;
• PDMS=Plasma Desorpsjon Massespec;
• TS=Termospray;
• AS=Aerospray;
• ESMS=Elektrospray Massespec.

Vanlige masseanalysatorakronymer inkluderer:

• EB = Elektrostatisk-Magnetisk;
• DET=ionfelle;
• Q=Quadrupole;
• Tof=Flytid.

Ioniseringsmetoder

Valg av riktig ioniseringsmetode for analysen av prøven er ekstremt viktig. Selv om vi kan tilby forslag, er det ditt ansvar å forstå og velge metoden (e) som passer for dine forskningsforbindelser.

• Electron Impact EI Ionisering
• Kjemisk Ionisering CI
• Negativ Ion Kjemisk Ionisering
• Elektrospray Ionisering Teknikker
• Matrix Assistert Lazer Desorpsjon (ikke tilbys i vårt anlegg, men tilgjengelig elswhere på campus)
• Atmosfærisk Trykk Kjemisk Ionisering APCI

Elektron INNVIRKNING IONISERING

M + E-(70ev) —–> M+. + 2e –

EI ioniseringsmetode er egnet for ikke-termolabile forbindelser. Volatiliteten til prøven er nødvendig. Prøvemolekyler i damptilstand bombarderes av raskt bevegelige elektroner, konvensjonelt 70 eV energi. Dette resulterer i iondannelse. En elektron fra den høyeste orbitale energien løsnes, og som en konsekvens dannes molekylære ioner. Noen av disse molekylære ioner dekomponerer og fragmentioner dannes. Fragmenteringen av en gitt ion skyldes overskudd av energi som det krever i ioniseringen. Fragment ioner kan være merkelig elektron eller elektron. Molekylære ioner dannet i elektron innvirkning ionisering er odde elektron ioner. Odde elektronfragmentioner dannes ved direkte spaltning(f. eks. direkte spaltning Av En C – c-binding). Selv elektronfragmentioner dannes ofte ved omlegging (f.eks. protonoverføring). Prøven kan innføres TIL EI-kilden via en gasskromatografienhet, for eksempel i tilfelle av blandinger, eller direkte via en faststoff sonde enhet. Mengdene som trengs for et eksperiment er vanligvis mindre enn et mikrogram av materiale.

EI massespektra, i de fleste tilfeller, inneholder intense fragment ion topper og mye mindre intens molekylær ion topp. Når den molekylære ionetoppen ikke observeres i massespektret, kan kjemisk ionisering brukes for å få molekylær ioninformasjon. En nyttig regel for å avgjøre om en ion er en molekylær ion Er Nitrogen Regelen.

Nitrogenregel: som angitt ovenfor er molekylære ioner dannet I EI ionisering odde elektronioner. Hvis deres observerte masse til ladningsforhold er merkelig, inneholder molekylet som undersøkes et merkelig antall nitrogenatomer. Hvis massen til ladningsforholdet er et jevnt tall, inneholder molekylet ingen Eller Til Og Med Nitrogenatomer.

Kjemisk Ionisering

For organiske kjemikere Er Kjemisk Ionisering (CI) spesielt nyttig teknikk når ingen molekylær ion observeres I EI massespektrum, og også ved bekreftelse av masse til ladningsforholdet for molekylær ion. Kjemisk ioniseringsteknikk bruker nesten samme ionkildeanordning som i elektronpåvirkning, unntatt, CI bruker tett ionkilde og reagensgass. Reagensgass (f. eks. ammoniakk) blir først utsatt for elektronpåvirkning. Prøveioner dannes ved samspillet mellom reagensgassioner og prøvemolekyler. Dette fenomenet kalles ionmolekylreaksjoner. Reagensgassmolekyler er tilstede i forholdet 100: 1 med hensyn til prøvemolekyler. Positive ioner og negative ioner dannes i CI-prosessen. Avhengig av oppsett av instrumentet (kildespenninger, detektor, etc…) bare positive ioner eller bare negative ioner registreres.

i CI oppstår ionmolekylreaksjoner mellom ioniserte reagensgassmolekyler (G) og flyktige analyttnøytrale molekyler (M) for å produsere analytioner. Pseudo-molekylær ion MH+ (positiv ionmodus) eller – (negativ ionmodus) observeres ofte. I motsetning til molekylære ioner oppnådd I EI-metoden, forekommer MH + og-deteksjon i høyt utbytte og mindre fragmentioner observeres.

Positiv ion modus:

GH+ + M- – – – – > MH+ + G

Negativ ion modus:

– + M ——> – + G

disse enkle protonoverføringsreaksjonene er sanne Gassfasesyrebaseprosesser I Bronsted-Lowrey-sansen. En» tett » ionkilde (trykk=0,1-2 torr) brukes til å maksimere kollisjoner som resulterer i økende følsomhet. For å finne sted må disse ionmolekylreaksjonene være eksoterme. Protonoverføring er en av de enkle prosessene som observeres i positiv CI:

RH+ + M – – – – > MH + + R

en av de avgjørende parameterne i denne reaksjonen er protonaffiniteten. For at reaksjonen skal skje, må protonaffiniteten Til molekylet M være høyere enn den ene av gassmolekylet. De viktigste reagensgassene som brukes i CI er: Ammoniakk, Metan og Isobutan. De dominerende reaktantioner dannet er gitt i mekanismene vist nedenfor. Valg av reagensgass påvirker omfanget av fragmentering av kvasi-molekylære ion.

Metan (positiv ion kjemisk ionisering):

• CH4 + e —–> CH4+. + 2e ——> CH3+ + H.
• CH4+. + CH4 —–> CH5+ +CH3.
• CH4+. + CH4 —–> C2H5+ + H2 + H.

Isobutane (positive ion chemical ionization):

• i-C4H10 + e —–> i-C4H10+. + 2e
• i-C4H10+. + i-C4H10 ——> i-C4H9+ + C4H9 +H2

Ammonia (positive ion chemical ionization):

• NH3 + e —–> NH3+. + 2e
• NH3+. + NH3 ——> NH4+ + NH2.
• NH4+ + NH3 ———>N2H7+

i metan positiv ion-modus kjemisk ionisering er de relevante prøvetoppene observert MH+, + og +; men hovedsakelig MH+. Dette tilsvarer massene M+1, M + 29 Og M + 41.

i isobutan positiv ion-modus kjemisk ionisering er hovedtoppen observert MH+.

i ammoniakk positiv ion modus kjemisk ionisering de viktigste toppene observert ER MH+ og +. Hvis mer enn ett protonasjonssted er til stede, kan FLERE NH3 addukter ses tilsvarende +. Dette tilsvarer massene M+1, M + 18 Og M+35.

i noen tilfeller kan protonerte dimerer eller andre addukter bli sett; tap AV H2O etterfulgt av protonasjon eller adduktjondannelse er sett for noen klasser av forbindelser. Hvis spekteret du observerer ikke ser ut til å vise de riktige adduktioner, eller viser omfattende fragmentering, vær forsiktig når du prøver å tolke resultatene. Det er en overflod av data tilgjengelig i litteraturen som diskuterer kjemiske ioniseringsmekanismer som gjelder for bestemte klasser av forbindelser.

To faktorer bestemmer valget av reagensgassen som skal brukes:

1. Protonaffinitet PA
2. energioverføring

NH3 (ammoniakk) er den mest brukte reagensgassen I KI på grunn av LAVENERGIOVERFØRING AV NH4+ sammenlignet MED CH5+ for eksempel. MED NH3 som reagensgass, observeres VANLIGVIS MH+ og MNH4+ (17 masseenheter forskjell).

Negativ Ion Kjemisk Ionisering

Tre mekanismer kan understrekes:

1. Elektronfangstreaksjon på grunn av oppnåelse av sakte bevegelige, lav energi «termaliserte» elektroner som kan overføres mer effektivt til prøvemolekyler.
2. elektronoverføring fra ionisert reagensgass (F.EKS. NH2 – kan overføre et elektron til et molekyl som har større elektronaffinitet enn NH2).
3. Reagensgassioner deltar i sanne CI-reaksjoner(f. eks. protonabstraksjon, i henhold til relative surheter).

Molekylære ioner observert i negative ion kjemiske ionisering massespekter er vanligvis M-eller -.

Elektrospray Ioniseringsmetode

blant de mest brukte spray ionisering teknikker Er Elektrospray Ionisering (ESI). Denne teknikken fortsetter å være den valgte metoden for å analysere termolabile kjemikalier. Dens evner er godt dokumentert. Kapillær) og motelektroden, som ligger få millimeter fra sonden. Prosessen resulterer i generering av høyt ladede dråper direkte fra den infuserte løsningen. Multipliser og / eller enkeltladede analyttmolekyler desorbe fra de sprøytede dråpene og samplet gjennom resten av massespektrometeret. ESI har blitt preget for sin evne til å produsere multiply ladede molekylære ioner fra et stort utvalg av polymerer som protein og DNA-fragmenter; det tillater også sensitiv deteksjon av enkeltladede lavmolekylære polare arter som narkotika og legemiddelmetabolitter. Dannelsen av positive eller negative ioner (avhengig av tegnet på det påførte elektriske feltet) forekommer i høyt utbytte. I positiv ion modus protonerte og / eller alkali adduct analytt molekyler generelt observert i massespektra. I negativ ion-modus observeres driftstopper som svarer til deprotonerte analyttmolekyler. ESI er beskrevet som en veldig » myk » ioniseringsteknikk der den omkringliggende badgassen har en modererende effekt på de indre og translasjonelle energiene til desorberte ioner.

Fordeler MED ESI:

• Myk ioniseringsprosess slik at intakte molekylære ioner observeres
• ESI tillater produksjon av multipliser ladede ioner. Dette resulterer i evnen til å analysere svært høy molekylvekt arter ved hjelp av de mest tilgjengelige masse analysatorer (f.eks quadrupol).
• ESI er en atmosfærisk trykkprosess. Dette gjør det enkelt å bruke OG enkelt å grensesnitt MED HPLC og CE separasjonsteknikker.

Matrix Assistert Laser Desorpsjon (MALDI)

Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) massespektrometri teknikk ble introdusert Av Karas Og Hillkamp i 1988 for ionisering av peptider og proteiner. Snart var det etter denne teknikken i stand til å analysere andre typer biomolekyler, som oligosakkarider, glykolipider, nukleotider og syntetiske polymerer. I denne teknikken blir prøver cocrystallized MED EN UV-absorberende substans kalt matrix. For eksempel for proteiner er matrisen av valg ofte sinapinsyre. En 337 nm stråling fra nitrogen laser er mest brukt. Laseren bidrar til å introdusere energi i molekylærsystemet på en slik måte at termisk dekomponering forhindres.

MALDI brukes ofte med massespektrometre ( TOF ) på grunn av teknikkens pulserende natur og masseområdekapasiteten. Molekylvekt opp til få hundre dalton kunne måles. Sammenligning AV MALDI og ESI ioniseringsteknikker ble forsøkt de siste årene. Etter min mening er disse to teknikkene ikke konkurransedyktige, men komplementære. BARE for å nevne noen, FOR høymolekylære arter, FØRER MALDI til dannelsen av enkeltladede molekylære ioner mens ESI tillater dannelsen av multipliser ladede molekylære ioner.

Praktiske hensyn:

• den endelige molforholdet prøve / matrise er omtrent eller rundt 1/5000.
• endelig konsentrasjon av prøven er fra 1 til 10 pmol/ul
• vår erfaring MED MALDI peker på et dynamisk område på 100 fmol/ul til få hundre pmol / ul
• MALDI er relativt robust ioniseringsteknikk som tåler bruk av salter og overflateaktive stoffer og buffere. Selv om det er best å fjerne dem for bedre ytelse.

Peptid – Og Proteinstandarder for MALDI:

• Angiotensin II (human) mw: 1046,2
• Substans P (human) MW: 1347,7
• Insulin (storfe) mw: 5733,6
• Cytokrom c (hest) mw: 12 360.1
• RNase A (storfe) MW: 13,682.2
• Apo-Myoglobin (hest) MW: 16,951.5
• Trypsinogen (bovin) MW: 23,980.9

Atmosfærisk Trykk Kjemisk Ionisering

APCI er en teknikk som skaper ioner ved atmosfærisk trykk. En prøveløsning strømmer gjennom et oppvarmet rør hvor det fordampes i en tåke og sprøytes inn i en koronautladning ved hjelp av nitrogennebulisering. Prøve molekylær er ionisert av ion molekyl reaksjoner fra ambiant corona utslipp ioner. Ioner produseres i utladningen og ekstraheres inn i massespektrometeret. APCI er best egnet til relativt polare, semi-flyktige prøver. ET APCI-massespektrum inneholdt vanligvis kvasi-molekylær ion, – eller +.

Analyse Av Ioner

det er mulig å bruke flere forskjellige fysiske parametere for å oppnå masseseparasjon. Vanlige typer masseanalysatorer er omtalt nedenfor. Hver har fordeler og ulemper. I vårt anlegg har vi For Tiden Quadrupole, Ion Trap, amd Time-of-Flight (TOF) massespektrometre.

Magnetisk Sektormassespektrometer

sektormassespektrometeret var en av de vanligste typene masseanalyser og sannsynligvis den mest kjente for den daglige forskeren. På 1950-tallet var de første kommersielle massespektrometrene sektorinstrumenter. De består av en kombinasjon av en stor elektromagnetisk og en slags elektrostatisk fokuseringsenhet. Ulike produsenter bruker ulike geometrier. Figur 1 viser en skjematisk av et standard ‘ BE ‘ geometri dobbelt fokuseringsinstrument. Be-konfigurasjonen kalles også omvendt geometri sektor massespektrometer-det vil si et dobbelt sektorinstrument bestående av en magnetisk sektor etterfulgt av en elektrostatisk sektor.

Ioner kommer inn i instrumentet fra kilden (nederst til venstre) der de først er fokusert. De går inn i den magnetiske sektoren gjennom kildespalten hvor de avbøyes i henhold til venstre regel. Ioner med høyere masse avbøyes mindre enn ioner med lavere masse. Skanning av magneten gjør det mulig å fokusere ioner av forskjellige masser på skjermspalten. På dette stadiet har ioner blitt separert bare av deres masser. For å oppnå et spektrum av god oppløsning der alle ioner med samme m/z vises sammenfallende som en topp i spekteret, må ioner filtreres av deres kinetiske energier. Etter en annen fase av fokusering går ionene inn i den elektrostatiske sektoren hvor ioner av samme m / z har deres energidistribusjoner korrigert for og er fokusert på det dobbelte fokuseringspunktet på detektorspalten.

Sektorinstrumenter hadde store kommersielle suksesser på 1950-og 1960-tallet, da De var den eneste praktiske måten å skaffe høyoppløselige data på. I de siste 20 årene eller så, med fallende priser PÅ FTMS og utvikling av høyoppløselige alternativer (For Eksempel Q-Tof) sektor instrumenter er i tilbakegang.

Time-of-Flight Massespektrometri (TOF-MS)

et time-of-flight massespektrometer bruker forskjellene i transittid gjennom et drivområde for å skille ioner av forskjellige masser. Den opererer i pulserende modus, slik at ioner må produseres eller ekstraheres i pulser. Et elektrisk felt akselererer alle ioner til et feltfritt drivområde med en kinetisk energi av qV, hvor q er ionladningen og V er den påførte spenningen. Siden ion kinetisk energi er 0,5 mv2, lettere ioner har en høyere hastighet enn tyngre ioner og nå detektoren på slutten av drift regionen før.

Teori:

• K. E. = qV
• 1/2 mv2 = qV
• v = (2qV / m)1/2

transittiden (t) gjennom drivrøret Er L / v hvor L er lengden på drivrøret

• t=L / (2V / m / q)1/2

Skjematisk av en lineær TOF-MS

denne skjematiske viser ablation av ioner fra en fast prøve med en pulserende laser. Reflectron er en serie ringer eller rister som fungerer som et ion speil. Dette speilet kompenserer for spredningen i kinetiske energier av ioner når de kommer inn i driftområdet og forbedrer oppløsningen av instrumentet. Utgangen av en iondetektor vises på et oscilloskop som en funksjon av tid for å produsere massespektret.

Ionfelle

Ioner opprettet av elektron impact (EI), electrospray (ESI) eller matrix-assisted laser desorption (MALDI) ionisering er fokusert ved hjelp av et elektrostatisk linsesystem i ionfellen. En elektrostatisk ionport pulserer åpen (- V) og lukket (+V) for å injisere ioner i ionfellen. Pulseringen av ionporten skiller ionfeller fra» stråle » – instrumenter som quadrupoles hvor ioner kontinuerlig kommer inn i masseanalysatoren. Tiden der ioner er tillatt i fellen, kalt «ioniseringsvarigheten», er satt til å maksimere signalet mens du minimerer romladningseffekter. Space-charge resultater fra for mange ioner i fellen som forårsaker en forvrengning av de elektriske feltene som fører til en samlet reduksjon i ytelse. Ionfellen er vanligvis fylt med helium til et trykk på ca 1 mtorr. Kollisjoner med helium demper den kinetiske energien til ionene og tjener til raskt å trekke baner mot midten av ionfellen, slik at fangst av injiserte ioner. Fangede ioner er videre fokusert mot midten av fellen ved bruk av et oscillerende potensial, kalt den grunnleggende rf , påført ringelektroden. En ion vil bli stabilt fanget avhengig av verdiene for massen og ladningen av ion, størrelsen på ionfellen (r), den oscillerende frekvensen til den grunnleggende rf ( w) og amplituden til spenningen på ringelektroden ( V). Avhengigheten av ionbevegelse på disse parametrene er beskrevet av den dimensjonsløse parameteren qz, qz = 4eV / mr2w2

Quadrupole

et quadrupole massefilter består av fire parallelle metallstenger arrangert som i figuren nedenfor. To motsatte stenger har et anvendt potensial på (U + Vcos (wt)) og de andre to stengene har et potensial på -(U + Vcos (wt)), Hvor U er en likespenning og Vcos (wt) er en vekselstrømspenning. De påførte spenningene påvirker banen av ioner som reiser nedover flybanen sentrert mellom de fire stengene. For gitt dc og ac spenninger passerer bare ioner med et bestemt masse-til-ladningsforhold gjennom quadrupole filteret og alle andre ioner kastes ut av sin opprinnelige bane. Et massespektrum oppnås ved å overvåke ioner som passerer gjennom quadrupole filteret da spenningene på stengene er varierte. Det er to metoder: varierende w og holder U og V konstant, eller varierende U Og V (U/V) fast for en konstant w.

et quadrupole massefilter består av fire parallelle metallstenger arrangert som i figuren nedenfor. To motsatte stenger ha

Tandem Massespektrometri:

Tandem Massespektrometri, vanligvis REFERERT TIL SOM MS/MS, innebærer bruk av 2 eller flere masseanalysatorer. Det brukes ofte til å analysere individuelle komponenter i en blanding. Denne teknikken legger til spesifisitet til en gitt analyse. Selv om tandem massespektrometri kan refereres TIL MS/ MS, MS / MS / MS, etc…, i denne presentasjonen skal jeg bare beskrive MS/MS.

DEN grunnleggende ideen OM MS/MS er et utvalg av en m / z av en gitt ion dannet i ionkilden, og underkast denne ion til fragmentering, vanligvis ved kollisjon med inert gass (f.eks . Argon). Produktioner blir deretter detektert. Dette er en kraftig måte å bekrefte identiteten til visse forbindelser og bestemme strukturen til ukjente arter. SÅ MS / MS er en prosess som involverer 3 trinn: ionisering, massevalg, masseanalyse.

MS / MS kan utføres på instrumenter som trippel quadrupole (QQQ), ionfelle, flytid, fourier-transformasjon, etc… Triple quadrupole er det mest brukte massespektrometeret FOR MS / MS, kanskje på grunn av kostnad og brukervennlighet blant andre faktorer.

Separasjonsmetoder For Kobling med Massespesifikasjon

• GC-MS: Prøveblandinger fordampes direkte og går inn i bundet smeltede silikasøyler. Komponenter av blandingen separeres basert på deres affinitetsforskjell med den bundne fasen. Separerte forbindelser går ut av kolonnen og går inn i vakuumsystemet til massespektrometeret. Prøvemolekyler ioniseres (EI eller CI), og akselereres til en prekalibrert masseanalysator (F. eks…). Retensjonstider, molekylmasser og fragmenteringsmønstre registreres. EN av DE viktigste considirations AV GC / MS er at prøven(e) må være ikke termolable betyr termisk stabil.
• LC-MS: for forbindelser som er termisk ustabile, vurderes lc / MS-metoden. Separasjonen er basert på diffrensen i affinitet av prøver med stasjonær fase og mobilfasen. f. eks. hydrofobisitet ved RP-kromatografi.
• CZE-MS: denne metoden er basert på diffrenser av elektroforetisk mobilitet av prøver når den smeltede silikakolonnen er under en potensiell forskjell mellom injeksjonssiden og detektorsiden.
• CIEF-MS: Dette er en variant AV CZE. Den er basert på diffrenser i isoelektriske punkter av analytter.