Tutorial de Espectrometría de Masas (Dr. Kamel Harrata)

Este tutorial analiza aspectos básicos de la espectrometría de masas que le serán útiles para decidir las técnicas y mediciones adecuadas para sus muestras de investigación.

• ¿Qué es la Espectrometría de masas?
• El Espectrómetro de masas
• Métodos de Ionización
  • Ionización por Impacto Electrónico
  • Ionización Química
  • Desorción Láser Asistida por Matriz
  • Ionización Química a presión Atmosférica
  • Ionización Electrospray
• Análisis de Iones
• Espectrometría de Masas en Tándem
• Métodos de Separación para Acoplamiento con Espectros de Masas

¿Qué es la Espectrometría de Masas?

La espectrometría de masas es una técnica analítica que consiste en el estudio en fase gaseosa de moléculas ionizadas con el objetivo de uno o más de los siguientes:

• Determinación del peso molecular
• Caracterización estructural
• Estudio de reactividad en fase gaseosa
• Análisis cualitativo y cuantitativo de componentes en una mezcla.

La espectrometría de masas consiste básicamente en pesar iones en fase gaseosa. El instrumento utilizado podría considerarse como un sofisticado equilibrio que determina con alta precisión las masas de átomos y moléculas individuales. Dependiendo de las propiedades químicas y físicas de las muestras, se pueden utilizar diferentes técnicas de ionización. Uno de los factores principales para elegir qué técnica de ionización se utilizará es la termolabilidad. Para muestras que no son solubles y relativamente volátiles, la ionización, como el Impacto de electrones y/o la Ionización química, se puede usar de manera efectiva. Para muestras termolábiles, como péptidos, proteínas y otras muestras de interés biológico, se deben considerar técnicas de ionización blanda. Entre las técnicas de ionización suave más utilizadas se encuentran el Electrospray (ESI) y la Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI). El nombre dado a una técnica de espectros de masa en particular generalmente apunta al método de ionización que se está utilizando.

Las masas atómicas y moleculares se asignan en relación con la masa del isótopo de carbono, 12C, cuyo peso atómico se define exactamente como 12. La masa real de 12C es de 12 dalton, con un dalton igual a 1.661 10-24 g. La masa de una molécula o un ion se puede presentar en daltones (Da) o kilodaltones (kDa).

El Espectrómetro de masas

La espectrometría de masas utiliza un instrumento llamado espectrómetro de masas. Los componentes principales de un espectrómetro de masas son:

• Sistema de entrada (LC, GC, sonda directa, etc…)
• Fuente de iones (EI, CI, ESI, APCI, MALDI, etc…)
• Analizador de masa (Cuadrupolo, TOF, Trampa de Iones, Sector Magnético)
• Detector (Multiplicador de Electrones, Placas de Microcanal MCPs)

Las muestras pueden introducirse en el espectrómetro de masas directamente a través de una sonda de sólidos o, en el caso de mezclas, por medio de un dispositivo de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de gases, cromatografía de líquidos, electroforesis capilar, etc.)…). Una vez en la fuente, las moléculas de muestra se someten a ionización. Los iones formados en la fuente (iones moleculares y fragmentos) adquieren cierta energía cinética y abandonan la fuente. Un analizador calibrado analiza los iones que pasan en función de su relación masa-carga. Se pueden usar diferentes tipos de analizador(s), Magnético, Cuadrulpol, Trampa de iones, Transformada de Fourier, Tiempo de vuelo, etc…A continuación, se detecta el haz de iones que sale del conjunto del analizador y se registra la señal. Los acrónimos comunes del método de ionización incluyen:

• EI = Impacto de Electrones;
• CI = Ionización Química;
• SIMS = Espec. de Masa de Iones Secundarios;
• FAB=Bombardeo Atómico Rápido;
• LDMS=Espec. de Masa de Desorción Láser;
• PDMS=Espec. de Masa de Desorción de Plasma;
• TS = Thermospray;
• AS = Aerospray;
• ESMS = Espectrometría de masas Electrospray.

Los acrónimos comunes del analizador de masas incluyen:

• EB = Electrostático magnético;
• IT = trampa de iones;
• Q = Cuadrupolo;
• TOF = Tiempo de vuelo.

Métodos de ionización

La selección del método de ionización adecuado para el análisis de su muestra es extremadamente importante. Aunque podemos ofrecer sugerencias, es su responsabilidad comprender y seleccionar los métodos apropiados para sus compuestos de investigación.

• Ionización EI de impacto electrónico
• Ionización química CI
• Ionización Química de Iones negativos
• Técnicas de Ionización Electrospray
• Desorción asistida por matriz de Lazer (no se ofrece en nuestras instalaciones, pero está disponible en cualquier lugar del campus)
• Ionización química a presión Atmosférica APCI

Ionización por impacto de electrones

M + e-(70eV) —–> M+. + 2e –

El método de ionización EI es adecuado para compuestos no termolábiles. Se requiere la volatilidad de la muestra. Las moléculas de muestra en estado de vapor son bombardeadas por electrones que se mueven rápidamente, convencionalmente energía de 70 eV. Esto da lugar a la formación de iones. Un electrón de la energía orbital más alta es desplazado, y como consecuencia se forman iones moleculares. Algunos de estos iones moleculares se descomponen y se forman fragmentos de iones. La fragmentación de un ion dado se debe al exceso de energía que requiere dentro de la ionización. Los iones fragmentados pueden ser electrones impares o electrones pares. Los iones moleculares formados en ionización de impacto de electrones son iones de electrones impares. Los iones de fragmentos de electrones impares se forman por escisión directa (p. ej. escisión directa de un enlace C-C). Incluso los iones de fragmentos de electrones a menudo se forman por reordenamiento (por ejemplo, transferencia de protones). La muestra se puede introducir en la fuente EI a través de un dispositivo de cromatografía de gases, por ejemplo, en el caso de mezclas, o directamente a través de un dispositivo de sonda de sólidos. Las cantidades necesarias para un experimento suelen ser inferiores a un microgramo de material.

Los espectros de masa EI, en la mayoría de los casos, contienen picos iónicos de fragmentos intensos y picos iónicos moleculares mucho menos intensos. Cuando el pico de iones moleculares no se observa en el espectro de masas, se puede usar ionización química para obtener información de iones moleculares. Una regla útil para determinar si un ion es un ion molecular es la Regla del nitrógeno.

Regla de nitrógeno: Como se indicó anteriormente, los iones moleculares formados en ionización EI son iones de electrones impares. Si su relación masa / carga observada es impar, la molécula bajo investigación contiene un número impar de átomos de nitrógeno. Si esa relación masa / carga es un número par, esa molécula no contiene átomos de nitrógeno o incluso átomos de nitrógeno.

Ionización química

Para los químicos orgánicos, la ionización química (CI) es una técnica especialmente útil cuando no se observa ningún ion molecular en el espectro de masa EI, y también en el caso de confirmar la relación masa / carga del ion molecular. La técnica de ionización química utiliza prácticamente el mismo dispositivo de fuente de iones que en el impacto de electrones, excepto que CI utiliza una fuente de iones hermética y gas reactivo. El gas reactivo (por ejemplo, amoníaco) se somete primero al impacto de electrones. Los iones de muestra se forman por la interacción de iones de gas reactivo y moléculas de muestra. Este fenómeno se denomina reacciones iónicas-moleculares. Las moléculas de gas reactivo están presentes en una proporción de aproximadamente 100: 1 con respecto a las moléculas de muestra. Los iones positivos y negativos se forman en el proceso de IC. Dependiendo de la configuración del instrumento (voltajes de fuente, detector, etc…) solo se registran iones positivos o negativos.

En CI, las reacciones de moléculas de iones ocurren entre moléculas de gas reactivo ionizado (G) y moléculas neutras de analito volátil (M) para producir iones de analito. A menudo se observan iones pseudomoleculares MH+ (modo de iones positivos) o-(modo de iones negativos). A diferencia de los iones moleculares obtenidos en el método EI, la detección de MH+ y – ocurre en un alto rendimiento y se observan menos fragmentos de iones.

Modo de iones positivos:

GH + + M – – – – – – > MH + + G

Modo de iones negativos:

– + M ——> – + G

Estas reacciones simples de transferencia de protones son verdaderos procesos Ácido-Base en fase gaseosa en el sentido Bronsted-Lowrey. Se utiliza una fuente de iones» apretada » (presión=0,1-2 torr) para maximizar las colisiones, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad. Para tener lugar estas reacciones de moléculas de iones deben ser exotérmicas. La transferencia de protones es uno de los procesos simples observados en IC positivo:

RH+ + M —–> MH+ + R

Uno de los parámetros decisivos en esta reacción es la afinidad de protones. Para que se produzca la reacción, la afinidad de protones de la molécula M debe ser mayor que la de la molécula de gas. Los principales gases reactivos utilizados en CI son: Amoníaco, Metano e Isobutano. Los iones reactivos predominantes formados se dan en los mecanismos que se muestran a continuación. La elección del gas reactivo afecta al grado de fragmentación del ion cuasimolecular.

Metano (ionización química de iones positivos):

• CH4 + e —–> CH4+. + 2e ——> CH3+ + H.
• CH4+. + CH4 —–> CH5+ +CH3.
• CH4+. + CH4 —–> C2H5+ + H2 + H.

Isobutane (positive ion chemical ionization):

• i-C4H10 + e —–> i-C4H10+. + 2e
• i-C4H10+. + i-C4H10 ——> i-C4H9+ + C4H9 +H2

Ammonia (positive ion chemical ionization):

• NH3 + e —–> NH3+. + 2e
• NH3+. + NH3 ——> NH4+ + NH2.
• NH4 + + NH3 ———>N2H7+

En la ionización química en modo de iones positivos de metano, los picos de muestra relevantes observados son MH+, + y+, pero principalmente MH+. Esto corresponde a las masas M + 1, M+29 y M+41.

En la ionización química en modo de iones positivos de isobutano, el pico principal observado es MH+.

En la ionización química en modo de iones positivos de amoníaco, los picos principales observados son MH+ y +. Si hay más de un sitio de protonación, se pueden ver aductos adicionales de NH3 correspondientes a +. Esto corresponde a las masas M+1, M + 18 y M+35.

En algunos casos, se pueden ver dímeros protonados u otros aductos; se observa pérdida de H2O seguida de protonación o formación de iones aductos para algunas clases de compuestos. Si el espectro que observa no parece mostrar los iones aductos adecuados, o muestra una fragmentación extensa, tenga cuidado cuando intente interpretar los resultados. Existen abundantes datos disponibles en la literatura sobre los mecanismos de ionización química aplicables a clases específicas de compuestos.

Dos factores determinan la elección del gas reactivo a utilizar:

1. Afinidad de protones PA
2. Transferencia de energía

NH3 (amoníaco) es el gas reactivo más utilizado en CI debido a la baja transferencia de energía de NH4+ en comparación con CH5+, por ejemplo. Con NH3 como gas reactivo, generalmente se observan MH+ y MNH4+ (diferencia de 17 unidades de masa).

Ionización química de iones negativos

Se pueden subrayar tres mecanismos:

1. Reacción de captura de electrones debido al logro de electrones «termalizados» de baja energía y movimiento lento que pueden transferirse de manera más eficiente a moléculas de muestra.
2. Transferencia de electrones del gas reactivo ionizado (por ejemplo, NH2 – puede transferir un electrón a una molécula que tenga una afinidad electrónica mayor que NH2).
3. Los iones de gas reactivo participan en reacciones de CI reales (por ejemplo, extracción de protones, de acuerdo con las acididades relativas).

Los iones moleculares observados en los espectros de masa de ionización química de iones negativos suelen ser M-o -.

Método de Ionización por Electrospray

Entre las técnicas de ionización por pulverización más utilizadas se encuentra la ionización por electrospray (ESI). Esta técnica sigue siendo el método de elección para analizar productos químicos termolábiles. Sus capacidades están bien documentadas. Utiliza una tensión eléctrica entre la salida de la sonda ESI (por ejemplo, capilar) y el electrodo contrario, que se encuentra a pocos milímetros de la sonda. El proceso da como resultado la generación de gotitas altamente cargadas directamente de la solución infundida. Las moléculas de analito multiplicadas y / o cargadas individualmente se desorban de las gotitas pulverizadas y se muestrean a través del resto del espectrómetro de masas. ESI se ha distinguido por su capacidad para producir iones moleculares con carga múltiple a partir de una gran variedad de polímeros, como fragmentos de proteínas y ADN; también permite la detección sensible de especies polares de bajo peso molecular con carga única, como drogas y metabolitos de drogas. La formación de iones positivos o negativos (dependiendo del signo del campo eléctrico aplicado) ocurre en un alto rendimiento. En el modo de iones positivos, las moléculas de analito de aductos alcalinos y/o protonados generalmente se observan en los espectros de masas. En el modo de iones negativos se observan picos de operación correspondientes a moléculas de analito desprotonadas. El ESI se describe como una técnica de ionización muy «suave» en la que el gas del baño circundante tiene un efecto moderador sobre las energías internas y de traslación de los iones desorbidos.

Ventajas de ESI:

• Proceso de ionización suave para que se observen iones moleculares intactos
• El ESI permite la producción de iones cargados multiplicados. Esto da como resultado la capacidad de analizar especies de peso molecular muy alto utilizando los analizadores de masa más disponibles (por ejemplo, cuadrupolos).
• ESI es un proceso de presión atmosférica. Esto hace que sea fácil de usar y fácil de interactuar con las técnicas de separación de HPLC y CE.

Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI)

La técnica de espectrometría de masas de Desorción Láser Asistida por matriz (MALDI) fue introducida por Karas y Hillkamp en 1988 para la ionización de péptidos y proteínas. Poco después de esta técnica fue capaz de analizar otro tipo de biomoléculas, como oligosacáridos, glicolípidos, nucleótidos y polímeros sintéticos. En esta técnica, las muestras se cocristalizan con una sustancia absorbente de rayos UV llamada matriz. Por ejemplo, para las proteínas, la matriz de elección a menudo es el ácido sinapínico. Una radiación de 337 nm de láser de nitrógeno es la más utilizada. El láser ayuda a introducir energía en el sistema molecular de tal manera que evita la descomposición térmica.

MALDI se usa a menudo con espectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF ) debido a la naturaleza pulsante de la técnica y la capacidad de rango de masa. Se podían medir pesos moleculares de hasta unos pocos cientos de daltons. La comparación de las técnicas de ionización MALDI y ESI se intentó en los últimos años. En mi opinión, estas dos técnicas no son competitivas, sino complementarias. Solo por nombrar algunos, para especies de alto peso molecular, MALDI conduce a la formación de iones moleculares de carga única, mientras que ESI permite la formación de iones moleculares de carga múltiple.

Consideraciones prácticas:

• La relación molar final muestra / matriz es de aproximadamente o alrededor de 1/5000.
• La concentración final de la muestra es de 1 a 10 pmol/ul
• Nuestra experiencia con MALDI apunta a un rango dinámico de 100 fmol/ul a pocos cientos pmol/ul
• MALDI es una técnica de ionización relativamente robusta que tolera el uso de sales, surfactantes y tampones. Aunque lo mejor es quitarlos para un mejor rendimiento.

Estándares de péptidos y proteínas para MALDI:

• Angiotensina II (humana) MW: 1046,2
• Sustancia P (humana) MW: 1347,7
• Insulina (bovina) MW: 5733,6
• Citocromo c (equino) MW: 12.360.1
• RNasa A (bovina) MW: 13,682.2
• Mioglobina apo (equina) MW: 16,951.5
• Tripsinógeno (bovino) MW: 23,980.9

Ionización Química a Presión Atmosférica

APCI es una técnica que crea iones a presión atmosférica. Una solución de muestra fluye a través de un tubo calentado donde se volatiliza en una niebla y se rocía en una descarga de corona con la ayuda de nebulización de nitrógeno. Las muestras moleculares son ionizadas por reacciones de moléculas de iones de los iones de descarga de corona ambiante. Los iones se producen en la descarga y se extraen en el espectrómetro de masas. El APCI es el más adecuado para muestras relativamente polares y semivolátiles. Un espectro de masa APCI generalmente contenía el ion cuasi-molecular, – o +.

Análisis de iones

Es posible utilizar varios parámetros físicos diferentes para lograr la separación de masa. Los tipos comunes de analizadores de masa se discuten a continuación. Cada uno tiene ventajas y desventajas. En nuestras instalaciones contamos actualmente con espectrómetros de masas Cuadrupolares, de trampa de iones y de Tiempo de Vuelo amd (TOF).

Espectrómetro de Masas de Sector Magnético

El espectrómetro de masas de sector era uno de los tipos más comunes de analizadores de masas y probablemente el más familiar para el científico cotidiano. En la década de 1950, los primeros espectrómetros de masas comerciales fueron instrumentos sectoriales. Consisten en una combinación de un gran electromagnético y algún tipo de dispositivo de enfoque electrostático. Diferentes fabricantes utilizan geometrías diferentes. La Figura 1 muestra un esquema de un instrumento de doble enfoque de geometría » BE » estándar. La configuración de BE también se denomina espectrómetro de masas de sector de geometría inversa, es decir, un instrumento de sector dual que consiste en un sector magnético seguido de un sector electrostático.

Los iones entran en el instrumento desde la fuente (abajo a la izquierda) donde se enfocan inicialmente. Entran en el sector magnético a través de la hendidura de la fuente donde se desvían de acuerdo con la regla de la izquierda. Los iones de mayor masa se desvían menos que los de menor masa. El escaneo del imán permite enfocar iones de diferentes masas en la ranura del monitor. En esta etapa, los iones se han separado solo por sus masas. Para obtener un espectro de buena resolución donde todos los iones con la misma m/z aparecen coincidentes como un pico en el espectro, los iones tienen que ser filtrados por sus energías cinéticas. Después de otra etapa de enfoque, los iones entran en el sector electrostático donde los iones del mismo m/z tienen sus distribuciones de energía corregidas y se enfocan en el punto de doble enfoque en la ranura del detector.

Los instrumentos de sector tuvieron grandes éxitos comerciales en los años 1950 y 1960, ya que eran la única forma práctica de obtener datos de alta resolución. En los últimos 20 años, aproximadamente, con la disminución de los precios de los MTF y el desarrollo de alternativas de alta resolución (por ejemplo, Q-Tof), los instrumentos del sector están en declive.

Espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS)

Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo utiliza las diferencias en el tiempo de tránsito a través de una región de deriva para separar iones de diferentes masas. Funciona en modo pulsado, por lo que los iones deben producirse o extraerse en pulsos. Un campo eléctrico acelera todos los iones en una región de deriva libre de campo con una energía cinética de qV, donde q es la carga de iones y V es el voltaje aplicado. Dado que la energía cinética de iones es de 0, 5mv2, los iones más ligeros tienen una velocidad más alta que los iones más pesados y alcanzan el detector al final de la región de deriva antes.

Teoría:

• K. E. = qV
• 1/2 mv2 = qV
• v = (2qV / m)1/2

El tiempo de tránsito (t) a través del tubo de deriva es L / v, donde L es la longitud del tubo de deriva

• t = L /(2V/m/q)1/2

Esquema de un TOF-MS lineal

Este esquema muestra la ablación de iones de una muestra sólida con un láser pulsado. El reflectron es una serie de anillos o rejillas que actúan como un espejo iónico. Este espejo compensa la dispersión de las energías cinéticas de los iones a medida que entran en la región de deriva y mejora la resolución del instrumento. La salida de un detector de iones se muestra en un osciloscopio en función del tiempo para producir el espectro de masa.Trampa de iones

Los iones creados por ionización por impacto de electrones (EI), electrospray (ESI) o desorción láser asistida por matriz (MALDI) se enfocan utilizando un sistema de lentes electrostáticas en la trampa de iones. Una compuerta de iones electrostática se abre (- V) y se cierra (+V) para inyectar iones en la trampa de iones. El pulso de la compuerta de iones diferencia las trampas de iones de los instrumentos de «haz», como los cuadrupolos, donde los iones entran continuamente en el analizador de masa. El tiempo durante el cual se permiten iones en la trampa, denominado «duración de ionización», se establece para maximizar la señal y minimizar los efectos de carga espacial. La carga espacial resulta de demasiados iones en la trampa que causan una distorsión de los campos eléctricos que conduce a una reducción general del rendimiento. La trampa de iones se llena típicamente con helio a una presión de aproximadamente 1 mtorr. Las colisiones con helio amortiguan la energía cinética de los iones y sirven para contraer rápidamente trayectorias hacia el centro de la trampa de iones, lo que permite atrapar los iones inyectados. Los iones atrapados se enfocan más hacia el centro de la trampa mediante el uso de un potencial oscilante, llamado rf fundamental , aplicado al electrodo anular. Un ion quedará atrapado de forma estable dependiendo de los valores de masa y carga del ion, el tamaño de la trampa de iones (r), la frecuencia oscilante del rf fundamental ( w) y la amplitud de la tensión en el electrodo anular ( V). La dependencia del movimiento iónico de estos parámetros se describe mediante el parámetro adimensional qz, qz = 4ev/mr2w2

Cuadrupolo

Un filtro de masa cuadrupolar consta de cuatro varillas metálicas paralelas dispuestas como en la figura de abajo. Junto a dos barras tienen un potencial aplicado de (U+Vco(wt)), y las otras dos barras tienen un potencial de -(U+Vco(wt)), donde U es un voltaje dc y Vco (wt) es un voltaje de ca. Los voltajes aplicados afectan la trayectoria de los iones que viajan por la trayectoria de vuelo centrada entre las cuatro varillas. Para voltajes de cc y ca dados, solo los iones de una cierta relación masa-carga pasan a través del filtro cuadrupolar y todos los demás iones se expulsan de su trayectoria original. Se obtiene un espectro de masa monitoreando los iones que pasan a través del filtro cuadrupolar a medida que los voltajes en las varillas son variados. Hay dos métodos: variando w y manteniendo constante U y V, o variando U y V (U/V) fijo para una constante w.

Un filtro de masa cuadrupolar consta de cuatro varillas metálicas paralelas dispuestas como en la figura a continuación. Dos varillas opuestas ha

Espectrometría de masas en Tándem:

La espectrometría de masas en tándem, generalmente conocida como MS / MS, implica el uso de 2 o más analizadores de masa. A menudo se utiliza para analizar componentes individuales en una mezcla. Esta técnica añade especificidad a un análisis dado. Aunque la espectrometría de masas en tándem se puede referir a MS / MS, MS / MS / MS, etc…, en esta presentación voy a describir solo MS/MS.

La idea básica de MS/MS es una selección de un m/z de un ion dado formado en la fuente de iones, y someter este ion a fragmentación, generalmente por colisión con gas inerte (ej. Argón). A continuación, se detectan los iones del producto. Esta es una forma poderosa de confirmar la identidad de ciertos compuestos y determinar la estructura de especies desconocidas. Entonces, MS / MS es un proceso que involucra 3 pasos: ionización, selección de masa, análisis de masa.

MS / MS se puede realizar en instrumentos como cuadrupolo triple (QQQ), trampa de iones, tiempo de vuelo, transformada de fourier, etc… El cuadrupolo triple es el espectrómetro de masas más utilizado para MS/MS, tal vez debido al costo y la facilidad de uso, entre otros factores.

Métodos de separación para acoplamiento con Espec. de masas

• GC-MS: Las mezclas de muestras se vaporizan directamente y entran en columnas de sílice fundida unida. Los componentes de la mezcla se separan en función de su diferencia de afinidad con la fase de unión. Los compuestos separados salen de la columna y entran en el sistema de vacío del espectrómetro de masas. Las moléculas de muestra se ionizan (EI, o CI) y se aceleran en un analizador de masa precalibrado (por ejemplo, Q, Trampa de iones, TOF, FTMS, etc.)…). Se registran los tiempos de retención, las masas moleculares y los patrones de fragmentación. Una de las consideraciones más importantes de GC/MS es que la muestra o muestras no deben ser termolables, es decir, térmicamente estables.
• LC-MS: Para compuestos térmicamente inestables, se considera el método LC / MS. La separación se basa en la difracción en afinidad de las muestras con la fase estacionaria y la fase móvil. por ejemplo, hidrofobicidad en caso de cromatografía RP.
• CZE-MS: Este método se basa en difrencias de movilidad electroforética de muestras cuando la columna de sílice fundida se encuentra bajo una diferencia de potencial entre el lado de inyección y el lado del detector.
• CIEF-MS: Esta es una variante de CZE. Se basa en diferencias en puntos isoeléctricos de analitos.