Fronteiras | siRNA o Software de Design para um Gene Alvo-Específicas de RNA de Interferência Genética

Introdução
Design optimizado de siRNA
STEP 1: Selection of Functional siRNA Sequence
Passo 2: Selecção da sequência siRNA com efeitos fora do alvo reduzidos
Passo 3: Eliminação de Genes Off-Target quase-perfeitos combinados
siRNA Design Software
conclusão
Declaração de conflito de interesses
Agradecimentos

Introdução

RNA de interferência (RNAi) é uma técnica amplamente utilizada pelos quais a pequena interferência de RNA (siRNA) downregulates um determinado gene alvo com perfeita complementares sequência, e prometeu usar na aplicação terapêutica de doenças humanas (Castanotto e Rossi, 2009; Ketting, 2011). Embora o ser humano tenha mais de 20.000 genes, é desejável usar siRNA que é altamente funcional e não tem efeitos em quaisquer genes além do seu alvo específico. Neste artigo, revisamos um método otimizado para projetar siRNA baseado no mecanismo da RNAi. Além disso, introduzimos os sites abertos ao público para selecionar sequências siRNA.

Design optimizado de siRNA

Duplexs of 21-nucleotide (nt) RNA with 2 nt 3′ overhangs (siRNA) is usually used for RNAi experiments. Após a entrega nas células, siRNAs são incorporadas ao complexo silenciador induzido pelo ARN (RISC) como um RNA de cadeia dupla. RISC é o complexo efetor contendo proteína Argonaute (Ago) com atividade cortadora (Hammond et al., 2001; Martinez et al., 2002). A cadeia guia siRNA que contém a extremidade termodinamicamente menos estável de 5’é preferencialmente retida por RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003; Ui-Tei et al., 2004). As cadeias de passageiros da maior parte das siRNAs de cadeia dupla carregadas no RISC são clivadas pela proteína Ago2 e degradadas (Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005; Leuschner et al., 2006). A cadeia guia retida tem pares de ARNm com sequência perfeitamente complementar, e reprime-a pela clivagem da proteína Ago2 na posição nucleótida 10 da cadeia guia siRNA (Elbashir et al., 2001; Hammond et al., 2001; Martinez et al., 2002). No entanto, uma evidência acumulada de experimentos em todo o genoma indica que um grande número de mRNAs com complementaridades parciais à linha guia também são reduzidas (Jackson et al., 2003, 2006; Lim et al., 2005; Birmingham et al., 2006; Ui-Tei et al., 2008). Este fenómeno é referido como efeito off-target dependente das sementes e, de preferência, observado no mRNA 3′ UTRs. O mecanismo de reconhecimento alvo deste efeito fora do alvo é conhecido por ser semelhante ao do silenciamento genético mediado por miRNA (Lewis et al., 2005; Lim et al., 2005; Grimson et al., 2007). As transcrições com sequências complementares à região de sementes posicionadas 2-8 a partir do terminal 5′ são principalmente reduzidas. A região de sementes é conhecida por estar situada na superfície de Ago em uma forma quase-helicoidal para servir como local de entrada ou nucleação para pequenas RNAs nos RISCs (Ma et al., 2005; Yuan et al., 2005). Assim, a região de sementes primeiro identifica o alvo mRNAs, e, posteriormente, formam um par perfeito de base com o alvo pretendido mRNA e induzem RNAi por Ago2.

com base no mecanismo de RNAi, um siRNA específico do gene alvo é considerado seleccionável de acordo com os três passos seguintes.

STEP 1: Selection of Functional siRNA Sequence

The knockdown eficiências of siRNAs are revealed to be highly dependent on their sequences. Nós defendemos a regra empiricamente baseada que prescrevia as características de siRNAs altamente funcionais (Ui-Tei et al., 2004), tal regra é chamada de regra Ui-Tei (Figura 1). O siRNA seleccionado pela regra Ui-Tei satisfaz simultaneamente as quatro condições seguintes:: (1) A ou U na posição 1 a partir de 5′ terminus do cabo de siRNA guide strand, (2) g ou C na posição 19, (3) AU richness (AU ≥4) nas posições 1-7 e (4) no long GC stretch ≥10. Com exceção de (4), nossa regra indicava que o siRNA funcional tem estabilidade assimétrica em terminais de 5′ e 3′. A nossa validação experimental com o ensaio de luciferase reporter mostrou que 98% das siRNAs que satisfazem as condições acima reduziram a expressão de luciferase reporter a menos de 33% (Ui-Tei et al., 2004). Outros grupos também demonstraram as regras de siRNAs altamente funcionais referidas como regra de Reynolds (Reynolds et al., 2004) e a regra Amarzguioui (Amarzguioui e Prydz, 2004) como resumida na Figura 1. Estas regras também mostraram claramente que as siRNAs funcionais são assimétricas: uma cadeia de RNA com um terminal instável de 5′ era eficaz como uma cadeia guia. Além disso, comum a estas regras, 5′ terminus do funcional de siRNA guia vertente era preferível ser Um ou U. foi revelado mais tarde que o resultado reflete as características estruturais de humanos Ago2 (Frank et al., 2010). A estrutura cristalina de um domínio médio (médio) de experimentos de titulação de AGO2 e NMR humanos mostrou que os monofosfatos de nucleótidos, AMP e UMP, se ligam com afinidade 30 vezes maior do que CMP ou GMP, fornecendo evidências estruturais para interações específicas de nucleótidos no domínio médio das proteínas eucarióticas AGO.

FIGURA 1

Figura 1. Representação esquemática para seleccionar siRNAs funcionais e fora do alvo. Seleção de siRNA altamente funcional por Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui regras, ou a combinação deles (Passo 1). Selecção de siRNAs com baixa estabilidade nos duplexes do alvo de sementes (Passo 2). Eliminação de siRNAs com sequências quase perfeitas para genes não-alvo (Passo 3). Em cada regra, a posição do nucleótido indica o número de nucleótidos contados a partir do Terminal 5′ da cadeia guia. www.frontiersin.org : a / U na posição 1. G / C na posição 19. 4 a 7 a / Us nas posições 1-7. sem alongamento GC ≥ 10. : teor de GC (30% -52%). a / U ≥ 3 nas posições 1-5. ausência de repetições internas. A na posição 1. A na posição 17. U na posição 10. Não G/C na posição 1. www.frontiersin.org Não G Na posição 7. : uma assimetria na estabilidade das extremidades duplex (medida como o diferencial A/U dos três basepairs terminais em cada extremidade do duplex). G Ou C na posição 19. A ou U na posição 1. A ou U na posição 14. não U na posição 19. Não G Na posição 1.

Passo 2: Selecção da sequência siRNA com efeitos fora do alvo reduzidos

para evitar efeitos fora do alvo dependentes de sementes, uma abordagem pode ser a selecção da cadeia guia siRNA cuja sequência de sementes não é complementar a quaisquer sequências nos 3′ UTR de todos os genes não visados. No entanto, esta abordagem provou ser impossível, porque as siRNAs humanas com a sequência de sementes de sete nt mais rara ainda tinham complementaridades de sementes com vários mRNAs não visados. Assim, temos procurado as regras que regem a capacidade de siRNAs para induzir o efeito off-target dependente de sementes, e revelou que a eficiência do efeito off-target é altamente correlacionada com a estabilidade termodinâmica do duplex formado entre a região de sementes de siRNA guide strand e seu alvo mRNA (Ui-Tei et al., 2008). A temperatura de fusão (Tm), um dos parâmetros termodinâmicos para a formação de ARN duplex, mostrou forte correlação positiva com a indução de efeitos dependentes de sementes fora do alvo. Assim, a seleção das siRNAs com Tm baixo do duplex do alvo-semente deve minimizar o silenciamento fora do alvo dependente da semente (Figura 1). O Tm de 21,5 ° C pode servir de referência, o que discrimina as sequências de sementes quase fora do alvo das sequências de sementes fora do alvo positivas. Além disso, uma vez que o efeito off-target pode ser causado não só pela linha guia, mas também pela linha de passageiros, siRNAs cujo TM-alvo de sementes é suficientemente baixo para ambas as cadeias são favoráveis.

Passo 3: Eliminação de Genes Off-Target quase-perfeitos combinados

mesmo quando o valor Tm do duplex do alvo-semente é suficientemente baixo, o silenciamento do gene-alvo ainda pode ocorrer se a região não-semente for completamente complementar. Portanto, na terceira etapa, as siRNAs que têm correspondências quase perfeitas a quaisquer outras transcrições não direcionadas foram eliminadas (Figura 1).

siRNA Design Software

we presented siRNA design software, siDirect 2.0 (http://siDirect2.RNAi.jp/; Figura 2), que fornece software de design siRNA funcional e específico de destino de acordo com os procedimentos acima mencionados (Naito et al., 2009). In default parameter, siRNAs satisfying Ui-Tei rule can be selected. Quando o candidato funcional siRNAs poderia formulário de sementes-alvo duplex com Tm valores abaixo de 21,5°C, e os seus 19-nt regiões de abrangência de posições 2-20 de ambas as vertentes têm, pelo menos, dois inadequação para qualquer outro não-alvo transcrições, siDirect 2.0 pode criar pelo menos um qualificado siRNA para >94% dos humanos seqüências de mRNA em RefSeq.

FIGURA 2

Figura 2. Screen views of siDirect 2.0 siRNA design software. (A) Top page (http://siDirect2.RNAi.jp/). B) parâmetros facultativos para a concepção do siRNA. (C) página do resultado. D) lista pormenorizada dos candidatos não visados com resultados quase perfeitos. O alinhamento entre cada transcrição fora do alvo e a sequência siRNA visualiza as posições de desfasamentos.

outros softwares para selecionar siRNAs funcionais foram abertos ao público como mostrado na Tabela 1. Em muitos deles, a regra Ui-Tei (Ui-Tei et al., 2004), Reynolds rule (Reynolds et al., 2004), Amarzguioui rule (Amarzguioui and Prydz, 2004), Tuschl rule (Elbashir et al., 2002), e a sua combinação foi frequente e amplamente utilizada. Para eliminar os genes não-alvo quase perfeitos, a busca por explosão foi usada para pesquisa de homologia em vários softwares. No entanto, uma vez que a busca de explosão não é tão precisa para sequências curtas como siRNAs, siDirect, WU-BLAST, e Bowtie, que são altamente precisos motor de busca de homologia para sequências curtas são frequentemente usados. Entre eles, siDirect 2.0 pode trazer os resultados mais precisos. Além disso, alguns dos softwares consideram as características adicionais, como a estrutura secundária mRNA (Ladunga, 2007; Lu e Mathews, 2008), splicing alternativo (Park et al., 2008), ou a sequência motif pela qual a resposta imunitária por um vírus RNA pode ocorrer (Gong et al., 2008). Estas características não são consideradas no siDirect 2.0. Assim, para levar em conta essas características, siRNAs comumente selecionados pela siDirect 2.0 e os outros programas de software apropriados podem produzir um resultado ótimo.

posição numa tabela 1

Quadro 1. Pequenos programas de design de RNA interferentes.

além disso, é praticamente consideração importante a utilização de dois ou mais siRNAs segmentação de diferentes sites em um alvo gene, desde a queda de efeitos de um alvo o gene é suposto ser o comum, mas o off-alvo, os efeitos podem ser diferentes entre siRNAs.

conclusão

sabe-se que a eficácia de cada siRNA varia muito dependendo da sua sequência em células de mamíferos, e apenas uma fracção limitada de siRNAs desenhadas aleatoriamente é funcional. Além disso, os efeitos silenciosos fora do alvo surgem quando o siRNA tem uma complementaridade parcial na região de sementes com genes não intencionais. Aqui, com base na maquinaria RNAi, descrevemos o design racional de siRNAs funcionais, com efeito fora do alvo reduzido, que são esperados para derrubar um gene alvo-especificamente.

Declaração de conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado por subsídios do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (MEXT), e a Célula de Inovação do Projeto (MEXT), e Núcleo de Projeto de Pesquisa para a Universidade Privada; correspondência fundo de subsídio para Kumiko Ui-Tei.

Amarzguioui, M., and Prydz, H. (2004). Um algoritmo para a selecção de sequências de siRNA funcionais. Bioquímica. Biophys. Res. Commun. 316, 1050–1058.