Frontiers | siRNA Software de diseño para una interferencia de ARN Específica del Gen Diana / Genética

Introducción
Diseño optimizado de siRNA
PASO 1: Selección de la Secuencia Funcional de ARNip
PASO 2: Selección de Secuencias de ARNip con Efectos Fuera del Objetivo Reducidos
PASO 3: Eliminación de Genes cercanos a la Diana Emparejados Casi Perfectos
Software de diseño siRNA
Conclusión
Declaración de Conflicto de Intereses
Reconocimientos

Introducción

La interferencia de ARN (ARNi) es una técnica ampliamente utilizada por la cual el ARN de interferencia pequeño (siRNA) regula a la baja un gen diana específico con una secuencia complementaria perfecta, y promete usarse en aplicaciones terapéuticas para enfermedades humanas (Castanotto y Rossi, 2009; Karting, 2011). Aunque el ser humano tiene más de 20.000 genes, es deseable utilizar el siRNA, que es altamente funcional y no tiene efectos en ningún otro gen que no sea su objetivo específico. En este artículo, revisamos un método optimizado para diseñar siRNA basado en el mecanismo del ARNi. Además, presentamos los sitios web abiertos al público para seleccionar secuencias de ARNip.

Diseño optimizado de siRNA

Los dúplex de ARN de 21 nucleótidos (nt) con voladizos de 2 nt 3′ (siRNA) se utilizan generalmente para experimentos con ARNi. Tras la entrega en las células, los ARN SIR se incorporan al complejo silenciador inducido por ARN (RISC) como ARN de doble cadena. RISC es el complejo efector que contiene proteína Argonauta (Ago) con actividad cortadora (Hammond et al., 2001; Martínez et al., 2002). La hebra guía siRNA que contiene el extremo 5’termodinámicamente menos estable es retenida preferentemente por RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003; Ui-Tei et al., 2004). Las hebras de pasajeros de la mayoría de los ARNIS de doble cadena cargados en RISC son escindidas por la proteína Ago2 y degradadas(Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005; Leuschner et al., 2006). Los pares de hebras guía retenidas apuntan al ARNm con una secuencia perfectamente complementaria, y lo reprimen por escisión de la proteína Ago2 en la posición 10 del nucleótido de la hebra guía del ARNip(Elbashir et al., 2001; Hammond et al., 2001; Martínez et al., 2002). Sin embargo, una evidencia acumulada de experimentos de todo el genoma indica que un gran número de ARNM con complementariedades parciales a la hebra guía también se reducen (Jackson et al., 2003, 2006; Lim et al., 2005; Birmingham et al., 2006; Ui-Tei et al., 2008). Este fenómeno se conoce como efecto fuera del objetivo dependiente de la semilla y se observa preferiblemente en ARNm 3 ‘ UTRs. Se sabe que el mecanismo de reconocimiento del objetivo de este efecto fuera del objetivo es similar al del silenciamiento génico mediado por miARN (Lewis et al., 2005; Lim et al., 2005; Grimson et al., 2007). Las transcripciones con secuencias complementarias a la región semilla posicionada 2-8 desde el terminal de 5’ se reducen principalmente. Se sabe que la región semilla está situada en la superficie de Ago en una forma cuasi-helicoidal para servir como sitio de entrada o nucleación para pequeños ARN en los RISC (Ma et al., 2005; Yuan et al., 2005). Por lo tanto, la región de la semilla primero identifica los ARNm objetivo, y posteriormente forma un emparejamiento perfecto de la base con el ARNm objetivo previsto e induce ARNi mediante Ago2.

Basado en el mecanismo del ARNi, un ARNip específico del gen diana se considera seleccionable de acuerdo con los tres pasos siguientes.

PASO 1: Selección de la Secuencia Funcional de ARNip

Las eficiencias de derribo de los ARNip se revelan altamente dependientes de sus secuencias. Defendimos la regla empírica que prescribía las características de los ARNIS altamente funcionales (Ui-Tei et al., 2004), dicha regla se denomina regla Ui-Tei (Figura 1). El siRNA seleccionado por la regla Ui-Tei cumple simultáneamente las siguientes cuatro condiciones: (1) A o U en la posición 1 desde el extremo 5′ de la hebra guía del ARNip, (2) G o C en la posición 19, (3) riqueza de AU (AU ≥4) en las posiciones 1-7, y (4) sin estiramiento largo de GC ≥10. A excepción de (4), nuestra regla indica que el siRNA funcional tiene estabilidad asimétrica en terminales de 5′ y 3′. Nuestra validación experimental mediante el ensayo del reportero de luciferasa mostró que el 98% de los ARNip que satisfacían las condiciones anteriores redujeron la expresión del reportero de luciferasa por debajo del 33% (Ui-Tei et al., 2004). Otros grupos también demostraron las reglas de siRNAs altamente funcionales conocidas como regla de Reynolds (Reynolds et al., 2004) y la regla de Amarzguioui (Amarzguioui y Prydz, 2004), como se resume en la Figura 1. Estas reglas también mostraron claramente que los siRNAs funcionales son asimétricos: una hebra de ARN con terminal inestable de 5′ era efectiva como hebra guía. Además, común en estas reglas, el término 5′ de la hebra guía funcional del ARNip era preferible a ser A o U. Se reveló más tarde que los resultados reflejaban las características estructurales de la Ago2 humana (Frank et al., 2010). La estructura cristalina de un dominio MEDIO (medio) de los experimentos de titulación AGO2 y RMN en humanos mostró que los monofosfatos de nucleótidos, AMP y UMP, se unen con una afinidad hasta 30 veces mayor que CMP o GMP, proporcionando evidencia estructural de interacciones específicas de nucleótidos en el dominio MEDIO de las proteínas eucarióticas AGO.FIGURA

Gráfico 1 Representación esquemática para seleccionar ARNIS funcionales y con efecto reducido fuera del objetivo. Selección de siRNA altamente funcional por reglas Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui, o la combinación de ellas (PASO 1). Selección de ARNIS con baja estabilidad en los dúplex objetivo de siembra (PASO 2). Eliminación de ARNIS con secuencias casi perfectas que coinciden con genes no diana (PASO 3). En cada regla, la posición del nucleótido indica el número de nucleótidos contados a partir del terminal 5′ de la hebra guía. www.frontiersin.org : A / U en la posición 1. G / C en la posición 19. 4 a 7 A / Us en las posiciones 1-7. Sin estiramiento de GC ≥ 10. : Contenido de CG (30% -52%). A / U ≥ 3 en las posiciones 1-5. Ausencia de repeticiones internas. A en la posición 1. A en la posición 17. U en la posición 10. www.frontiersin.org No G / C en la posición 1. No G en la posición 7. : Asimetría en la estabilidad de los extremos dúplex (medida como el diferencial A / U de los tres pares base terminales en cada extremo del dúplex). G o C en la posición 19. A o U en la posición 1. A o U en la posición 14. www.frontiersin.org No U en la posición 19. No G en la posición 1.

PASO 2: Selección de Secuencias de ARNip con Efectos Fuera del Objetivo Reducidos

Para evitar efectos fuera del objetivo dependientes de la semilla, un enfoque puede ser seleccionar la cadena guía de ARNip cuya secuencia de semilla no es complementaria a ninguna secuencia en el 3′ UTR de todos los genes no objetivo. Sin embargo, se ha demostrado que este enfoque es imposible, porque los ARNR humanos con la secuencia de semillas de siete nt más infrecuente aún tenían complementariedades de semillas con varios ARNm no dirigidos. Por lo tanto, hemos buscado las reglas que rigen la capacidad de los ARNIS para inducir el efecto fuera del objetivo dependiente de la semilla, y revelamos que la eficiencia del efecto fuera del objetivo está altamente correlacionada con la estabilidad termodinámica del dúplex formado entre la región de la semilla de la hebra guía de arNIS y su ARNm objetivo (Ui-Tei et al., 2008). La temperatura de fusión (Tm), uno de los parámetros termodinámicos para la formación de ARN dúplex, mostró una fuerte correlación positiva con la inducción de efectos fuera del objetivo dependientes de la semilla. Por lo tanto, la selección de siRNAs con Tm baja del dúplex semilla-objetivo debe minimizar el silenciamiento fuera del objetivo dependiente de la semilla (Figura 1). La Tm de 21,5°C puede servir como punto de referencia, que discrimina las secuencias de semillas casi fuera de objetivo de las secuencias positivas fuera de objetivo. Además, dado que el efecto fuera del objetivo puede ser causado no solo por la hebra guía, sino también por la hebra pasajera, los ARNR cuya Tm de objetivo de semilla es suficientemente baja para ambas hebras son favorables.

PASO 3: Eliminación de Genes cercanos a la Diana Emparejados Casi Perfectos

Incluso cuando el valor de Tm del dúplex semilla-objetivo es suficientemente bajo, el silenciamiento del gen objetivo aún puede tener lugar si la región no semilla es completamente complementaria. Por lo tanto, en el tercer paso, se eliminaron los ARNR que tenían coincidencias casi perfectas con cualquier otra transcripción no dirigida (Figura 1).

Software de diseño siRNA

Presentamos el software de diseño siRNA, siDirect 2.0 (http://siDirect2.RNAi.jp/; Figura 2), que proporciona un software de diseño de ARNip funcional y específico para el objetivo de acuerdo con los procedimientos mencionados anteriormente (Naito et al., 2009). En el parámetro predeterminado, se puede seleccionar la regla Ui-Tei de siRNAs que satisfaga. Cuando los ARNr funcionales candidatos podrían formar duplicados de objetivo semilla con valores de Tm por debajo de 21,5°C, y sus regiones de 19 nt que abarcan las posiciones 2-20 de ambos filamentos tienen al menos dos desajustes con cualquier otra transcripción no objetivo, siDirect 2.0 puede diseñar al menos un ARNr calificado para >94% de secuencias de ARNm humanos en RefSeq.FIGURA

Gráfico 2 Vistas de pantalla del software de diseño siRNA siDirect 2.0. A) Página superior (http://siDirect2.RNAi.jp/). B) Parámetros opcionales para el diseño de siRNA. C) Página de resultados. D) Lista detallada de candidatos no seleccionados con coincidencias casi perfectas. La alineación entre cada transcripción fuera de objetivo y la secuencia de siRNA visualiza las posiciones de los desajustes.

Otros programas informáticos para seleccionar SIRNAS funcionales estaban abiertos al público, como se muestra en la Tabla 1. En muchos de ellos, la regla Ui-Tei (Ui-Tei et al., 2004), regla de Reynolds (Reynolds et al., 2004), la regla de Amarzguioui (Amarzguioui y Prydz, 2004), la regla de Tuschl (Elbashir et al., 2002), y la combinación de ellos se utilizó con frecuencia y ampliamente. Para eliminar los genes no objetivo casi perfectos, se utilizó la búsqueda de EXPLOSIONES para la búsqueda de homología en varios programas informáticos. Sin embargo, dado que la búsqueda de EXPLOSIONES no es tan precisa para secuencias cortas como siRNAs, siDirect, WU-BLAST y Bowtie, que son motores de búsqueda de homología altamente precisos para secuencias cortas se utilizan a menudo. Entre ellos, siDirect 2.0 puede traer los resultados más precisos. Además, algunos de los programas tienen en cuenta las características adicionales, como la estructura secundaria de ARNm (Ladunga, 2007; Lu y Mathews, 2008), el empalme alternativo (Park et al., 2008), o la secuencia de motivos por la que podría ocurrir la respuesta inmune de un virus de ARN (Gong et al., 2008). Estas características no se consideran en siDirect 2.0. Por lo tanto, para tener en cuenta estas características, los SIRNAS comúnmente seleccionados por siDirect 2.0 y otros programas de software apropiados pueden producir un resultado óptimo.

CUADRO 1

Cuadro 1 Pequeños programas de software de diseño de ARN de interferencia.

Además, es prácticamente importante considerar el uso de dos o más ARNip dirigidos a diferentes sitios en un gen objetivo previsto, ya que se supone que los efectos de derribo de un gen objetivo previsto son comunes, pero es probable que los efectos fuera del objetivo sean diferentes entre los ARNip.

Conclusión

Se sabe que la eficacia de cada siRNA varía ampliamente dependiendo de su secuencia en células de mamíferos, y solo una fracción limitada de siRNAs diseñados aleatoriamente es funcional. Además, los efectos silenciadores fuera del objetivo surgen cuando el siRNA tiene complementariedad parcial en la región de la semilla con genes no deseados. Aquí, basado en la maquinaria de ARNi, describimos el diseño racional de ARNIS funcionales, con efecto fuera del objetivo reducido, que se espera que derriben un gen objetivo, específicamente.

Declaración de Conflicto de Intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses potencial.

Reconocimientos

Este trabajo fue apoyado parcialmente por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (MEXT), y el Proyecto de Innovación Celular (MEXT), y el Proyecto de Investigación Central para Universidad Privada; subsidio de fondo de contrapartida a Kumiko Ui-Tei.

Amarzguioui, M., and Prydz, H. (2004). Un algoritmo para la selección de secuencias de ARNip funcionales. Bioquímica. Biophys. Res. Commun. 316, 1050–1058.